Ристоцетин это



Агрегация тромбоцитов — это концентрация определенных клеток крови (бляшек Биццоцеро) для ликвидации повреждения сосуда, сопровождающегося кровопотерей. Нарушение целостности при незначительном повреждении мелких сосудов на фоне нормального гемостаза не грозит массивной потерей крови. Небольшое кровотечение, по мнению многих людей, спустя короткое время самопроизвольно останавливается. Не всем известно, что в этом сложном процессе предотвращения значительной кровопотери очень многое зависит от агрегации тромбоцитов.

Содержание:

Агрегация тромбоцитов или естественная остановка кровотечения

Агрегация тромбоцитов

Процесс остановки кровотечения в сосудистой сети (капилляры, венулы, артериолы) проходит через несколько стадий:


  • После повреждения сосуда происходит его спазм, что позволяет частично снизить интенсивность кровотечения.

  • На участке травматизации сосудистой стенки концентрируются кровяные пластины, которые частично закрывают собой дефект поврежденного участка – происходит адгезия тромбоцитов.

  • На участке дефекта сосуда накапливаются тромбоциты, образуя конгломераты, это агрегация тромбоцитов, первый этап формирования тромба.

  • В результате необратимой агрегации образуется тромбоцитарная пробка. Она рыхлая, держится непрочно на ране, при легком механическом воздействии на нее кровотечение возобновляется.

  • Под влиянием тромбопластина фибриновых нитей кровяная пробка приобретает плотность, сжимается, происходит ретракция тромбинового тромба, кровопотеря прекращается.

На картинке ниже представлены этапы образования тромба:

этапы образования тромба

Агрегация тромбоцитов при остановке кровотечения не конечная стадия важного процесса, но от этого ее значение не становится меньше. У этого явления, исключительно важного при остановке кровотечения, имеется обратная сторона. При повышенной агрегации тромбоцитов кровяные пластинки даже в отсутствие кровотечения склеиваются, образуя тромбы. Эти сгустки, передвигаясь по кровеносным сосудам, провоцируют их закупорку, нарушая кровоснабжение органов.


Именно так происходит инфаркт миокарда, инфаркт легкого, почки, ишемический инсульт головного мозга. В этих случаях проводится активная терапия антиагрегантами, назначаемая для профилактики и лечения тромбоза.

Незначительная на первый взгляд патологическая реакция спонтанной агрегации кровяных пластинок может привести к тромбоэмболии ведущих артерий, и даже к смерти больного.

Что говорит агрегация тромбоцитов в анализе крови?

Для исследования способности тромбоцитов к агрегации в лаборатории создают имитацию естественных условий – циркуляции клеток крови в кровотоке.

Это исследование проводят на стекле с добавлением веществ-индукторов, в норме участвующих в аналогичных реакциях в человеческом организме:

  • Адреналин;

  • Коллаген;

  • АДФ;

  • Тромбин.

В качестве индуктора дополнительно применяют ристомицин (ристоцеин), не имеющий аналогов в организме человека. Каждый индуктор агрегации тромбоцитов имеет свой диапазон нормы, несколько отличающийся в разных лабораторных условиях.

Норма агрегации тромбоцитов в зависимости от индуктора реакции


Способ определения агрегации тромбоцитов

Норма,%

Анализ крови с АДФ

30,8 – 77,8

Анализ крови с адреналином

35,0 – 92,5

Анализ крови с коллагеном

46,5 – 93,2

Анализ крови с ристомицином

58 – 167

Для диагностики сердечнососудистых патологий большое значение имеет определение спонтанной агрегации тромбоцитов, когда склеившиеся между собой пластинки кровяных клеток циркулируют по кровеносной системе.

Нарушения в зоне микроциркуляции:

  • Изменения сосудистых стенок в зоне микроциркуляции;

  • Образование агрегатов из тромбоцитов, повышающих риск развития патологии сердца и сосудов, серьезных осложнений.

Методы определения параметров САТ:

  • Изменение оптической плотности суспензии кровяных пластинок;

  • Визуальная оценка агрегирования тромбоцитов.

В лабораторных условиях для диагностики патологической агрегации тромбоцитов используют:

  • Оптические агрегометры – регистрируют агрегацию тромбоцитов в плазме;

  • Кондуктометрические агрегометры – измеряют уровень агрегации в цельной крови.


Полученные данные отображают в виде кривой на агрегатограмме. Метод лабораторной диагностики уровня агрегации тромбоцитов надежен, но требует высокой трудоемкости, большого объема плазмы крови.

Норма и отклонение при беременности

Норма и отклонение

Отклонения от нормы уровня агрегации тромбоцитов в любую сторону – признак патологии. При беременности обязательно требуется проведение анализ крови для определения риска тромбообразования. В последнем триместре беременности женский организм готовится к возможной кровопотере, умеренно повышая показатели свертываемости крови. Если выявлена гиперагрегация тромбоцитов, нужно корректировать это состояние.

При пониженных показателях растет риск кровотечений, при повышенных – увеличивается опасность тромбоза. Чтобы беременность протекала благополучно, требуется расположение агрегационных возможностей тромбоцитов в пределах нормы – от 30 до 60%.

Уточнить диапазон нормы можно в лаборатории, где специалист сообщит о риске повышенной или пониженной интенсивности агрегации, о вероятности негативных осложнений беременности.

Агрегация тромбоцитов с индукторами


По стандарту для более точной диагностики процесса анализ крови на определение уровня агрегации тромбоцитов проводится не менее чем с 4 индукторами.

Индуктор АДФ

Индуктор АДФ

Проведение диагностики с АДФ позволяет выявить сбой процесса при следующих заболеваниях и состояниях:

  • Ишемия, инфаркт миокарда;

  • Атеросклероз;

  • Сахарный диабет;

  • Артериальная гипертензия;

  • Нарушение мозгового кровообращения;

  • Гиперлипопротеинемия;

  • Тромбопатия наследственного генеза;

  • Тромбоцитопатия при гемобластозе;

  • Прием препаратов, затормаживающих активность тромбоцитов.

Заболевания, провоцирующие снижение уровня агрегации тромбоцитов:

  • Эссенциальная атромбия – нарушение функциональности тромбоцитов;

  • Синдром вискотта-олдрича – редкое генетически обусловленное заболевание, возникает в зависимости от пола больного, связано с изменениями размера и формы клеток;

  • Тромбастения гланцмана – генетическое заболевание, выражающееся в отсутствии рецепторов к фибриногену и гликопротеинам;

  • Тромбоцитопатия при уремии;

  • Аспириноподобный синдром – нарушение второй фазы агрегации тромбоцитов;

  • Вторичные нарушения агрегации тромбоцитов при гемобластозе, гипотиреозе, терапии с применением антиагрегантов, нпвп, диуретиков, антибактериальных препаратов и средств для снижения артериального давления.


Заболевания, провоцирующие повышение уровня агрегации тромбоцитов:

  • Активация системы свертывания при психоэмоциональных нагрузках, образовании иммунных комплексов, приеме определенных лекарственных препаратов;

  • Резистентность к аспирину;

  • Синдром вязких тромбоцитов: повышенный уровень агрегации, предрасположенность к адгезии.

Индуктор коллаген

Выход за пределы нормативных показателей при реакции с использованием коллагена диагностируется при нарушениях на стадии адгезии. Снижение уровня агрегации кровяных пластин имеет ту же причину, что и при пробах с АДФ. Повышение уровня сопровождает васкулиты, синдром вязких тромбоцитов.

Индуктор с адреналином

Исследование показателей агрегационной способности тромбоцитов в пробе с адреналином считается наиболее информативным диагностическим методом. Он в полной мере показывает внутренние механизмы активации, в том числе «реакцию освобождения». Снижение нормативного показателя характерно для аналогичных поводов, обнаруженных при реакции с АДФ и с коллагеном. Повышение интенсивности агрегации тромбоцитов связано с повышенной вязкостью кровяных пластинок, со стрессом, с приемом определенных препаратов.


Индуктор с ристоцетином

Исследование проводится при диагностировании синдрома Виллебранда. Изучение ристоцетин-кофакторной активности тромбоцитов помогает обнаружить степень выраженности этого фактора.

Все виды диагностики с использованием индукторов агрегации позволяют объективно оценить функциональность кровяных пластинок. Еще одно назначение диагностики – оценка эффективности применения антиагрегантов, помощь при подборе дозировки препаратов.

Дополнительная информация

Склеивание кровяных пластинок, образование гемостатической пробки включает в себя сложные методы активации тромбоцитов и следующие за ними реакции.

В чем роль тромбоцитов?

В чем роль тромбоцитов

Функции кровяных клеток в осуществлении сосудисто-тромбоцитарного гемостаза:

  • Обеспечение ангиотрофической функции для поддержания нормального строения и функциональности сосудистых стенок мелких венул и артериол.

  • Обеспечение адгезивно-агрегационной функции, заключающееся в концентрации тромбоцитов и приклеивании их к поврежденной базальной мембране сосуда (адгезия), формирования гемостатической пробки (агрегация), что позволяет за короткое время остановить кровотечение.

  • Поддержание спазма поврежденных капилляров для профилактики усиления кровопотери.

  • Участие в процессах свертывания, в реакциях фибринолиза.


Адгезивно-агрегационная функция включает в себя адгезию и агрегацию кровяных телец, обнаруженные исследователями еще в 19 веке. Пробка из тромбоцитов формируется до транспортирования ее к месту повреждения базальной мембраны.

Основной стимулятор прикрепления тромбоцитарной пробки – коллаген, хотя эти функции могут выполнять и другие компоненты соединительной ткани.

Изменения внешнего вида и функциональности тромбоцитов при кровотечении

Изменения внешнего вида

При травме сосуда подготовка тромбоцитов к реагированию начинается задолго до прибытия на место чрезвычайной ситуации:

  • Они меняют свою форму с плоской дисковидной на сферическую, обзаводятся псевдоподиями. Эти отростки предназначены для связывания друг с другом и прикрепления к базальной мембране сосуда.

  • Прибыв к месту аварийной ситуации, кровяные пластины готовы к активации адгезии и агрегации, они прикрепляются к стенкам сосуда быстрее 5 секунд.

  • Тромбоциты, расположенные в пространстве кровеносной системы, концентрируются в конгломераты, насчитывающие 3-20 клеток.

  • Конгломераты, прибывшие к участку повреждения, объединяются с тромбоцитами, первично адгезированными в месте оголения базальной мембраны.


Все стадии этого процесса направлены на интенсивное увеличение гемостатической пробки, за короткое время закрывающей повреждение сосуда и останавливающее кровотечение.

Концентрация клеток как сложный биохимический процесс

В процессе адгезии и агрегации тромбоцитов участвуют внешние и внутренние факторы:

  • Затраты энергии;

  • Стимуляторы реакции;

  • Перестройка структуры клеток.

Например, тромбоциты не могут осуществить свои функции без гликопротеина – плазменного кофактора к коллагену (фактор Виллебранда). Он продуцируется в сосудистых стенках, и тромбоциты, продвигаясь по венам и артериям, откладывают его впрок в своих гранулах, чтобы выделять в случае необходимости.

Концентрация клеток

Стимуляторы агрегации тромбоцитов, включающиеся в режиме активации:


  1. Коллаген – наиболее значимый стимулятор.

  2. АДФ – в начальной стадии агрегации выделяется из поврежденной базальной мембраны сосудистой стенки и из эритроцитов в районе травмы, затем выделяется тромбоцитами, прошедшими через первичную адгезию и активацию.

  3. Адреналин и серотонин – активируют мембранные ферменты тромбоцитов, способствуют образованию арахидоновой кислоты и тромбоксана, интенсивно активирующих реакцию.

  4. Простагландины – при активации образуют в гладкой мускулатуре тромбоксан, на последней стадии агрегации обеспечивают поступление в кровь простациклина, подавляющего уже не нужную активность тромбоцитов.

  5. Тромбин – способствует укреплению и увеличению прочности гемостатической пробки.

Ориентируясь в механизме реакции гемостаза тромбоцитов, можно понять этиологию заболеваний, связанных с нарушением свертываемости крови.

Уязвимость концентрации клеток в крови

Уязвимость концентрации

Отдельные эндогенные и экзогенные факторы провоцируют патологические процессы в механизме гемостаза тромбоцитов.

Самое уязвимое место – «реакция освобождения», когда не происходит соединения и склеивания кровяных пластинок, не образуется гемостатическая пробка.

Для качественного осуществления процесса свертывания крови необходимо наличие белков: фибриногена, альбумина, гамма-фракции, а так же фосфолипидного фактора, Ca2+, Mg2+. Белки создают «плазматическую атмосферу» для полноценного функционирования тромбоцитов, но часть производных белкового расщепления могут затормаживать агрегацию кровяных пластин, особенно те, что были получены при распаде фибриногена и фибрина.

Если все участники тромбоцитарного гемостаза выполняют свои функции, агрегация этих клеток крови способна прекратить кровотечение, но в крупных сосудах, где кровь циркулирует под высоким давлением, гемостатическая пробка не способна это сделать.

Источник: www.ayzdorov.ru

УДК 616-008.852-577.182.84

К. Кастаман

Резюме и комментарии

Центр гемофилии и тромбозов, Отделение клеточной терапии и гематологии, Больница Сан-Бортоло, г. Виченца, Италия

Оригинальное название:

A comparative evaluation of a new automated assay for von Willebrand factor activity. Сравнительная оценка нового автоматизированного анализа активности фактора Виллебранда. Lawrie AS, Stufano F, Canciani MT, Mackie IJ, Machin SJ, Peyvandi F. Haemophilia 2013; 19(2): 338

РИСТОЦЕТИН ДЛЯ АНАЛИЗА ФАКТОРА ФОН ВИЛЛЕБРАНДА: НУЖЕН ЛИ ОН НАМ?

Резюме

Ристоцетин-кофакторный анализ (ФфВ^Оз) является основным методом для оценки активности фактора фон Виллебранда (ФфВ) при диагностировании болезни Виллебранда (БВ). Тем не менее, этот анализ отличается плохой воспроизводимостью и малой чувствительностью при низких уровнях ФфВ, и является достаточно трудоемким. В данной работе Lawrie и соавт. оценили производительность нового иммунотурбидиметрического анализа для определения активности ФфВ (INNOVaNCE® VWF Ac., Siemens Healthcare Diagnostics, Марбург, Германия). В этом анализе ристоцетин и тромбоциты не используются и заменены фрагментом рекомбинантного гликопротеина тромбоцитов Ib (GPIb) с искусственно введенными мутациями, улучшающими связывание ФфВ с GPIb.

В анализе использовали 50 нормальных контрольных образцов, образцы крови от 80 пациентов с БВ и 50 образцов с признаками гемолиза, желтухи или липемии, которые сравнили с данными классического, основанного на тромбоцитах теста ФфВ^йз. Корреляция с результатами ФфВ^йз была удовлетворительной, как и рассчитанное соотношение ФфВ:Ас и ФфВ^йз к ФфВ:Аг (рис. 1). Тем не менее, предел обнаружения ФфВ: Ас был ниже по сравнению с ФфВ^бз (3 Ед/дл и 5 Ед/дл, соответственно). Авторы пришли к выводу, что новый анализ является надежным и более чувствительным, чем ФфВ^Оз при низкой концентрации ФфВ. Анализ является простым и менее трудоемким для проведения в неспециализированных лабораториях.

Ключевые слова: Ристоцетин-кофакторный анализ, иммунотурбидиметрический анализ, образцы крови, эксперимент.

Комментарии

В 1975 г. Macfarlane и сотрудники опубликовали новый метод для анализа уровней ФфВ в плазме [1]. Метод был назван «ристоцетин-кофакторная активность ФфВ» (ФфВ^Оз, или ФфВ:РКА) и основан на способности ристоцетина вызывать агрегацию тромбоцитов в реакции, зависимой от наличия/отсутствия мультимеров фактора фон Виллебранда с высоким молекулярным весом. Техника этого анализа берет начало из наблюдений о том, что прием антибиотика ристоцетина, назначаемого для терапии различных заболеваний с начала 60-ых годов ХХ века, часто сопровождается тромбоцитопенией как побочным эффектом [2]. Антибиотик был впоследствии отозван с рынка, однако демонстрация того, что тромбоцитопе-ния вызвана взаимодействием ФфВ с гликопротеином ^ ^Ь) на поверхности тромбоцитов, легла в основу нового способа анализа функции ФфВ в плазме пациента. С помощью этого метода определяется активность ФфВ путем измерения скорости и степени агглютинации в перемешиваемой суспензии тромбоцитов в ответ на фиксированную дозу ристоцетина (обычно 1 мг/мл после добавления последовательно разведенной плазмы пациента или нормальной контрольной плазмы). Тем не менее, было обнаружено, что анализ является плохо воспроизводимым, трудоемким и обладающим сравнительно малой чувствительностью к низким уровням ФфВ в плазме пациента. Дальнейшие исследования указали на несколько требований, которые рекомендуется выполнять для полу-

чения более надежных результатов классического ристоцетин-теста.

Рисунок 1. Корреляция между соотношениями ФфВ^^ и ФфВ:Ас к ФфВ:Аг в образцах, полученных от пациентов с БВ. Пунктирная линия соответствует соотношению 0,7. Сотношение <0,7 связано с дисфункциональным ФфВ.

1: БВ типа 2 / !Е (мутация р.Р1127_в11Ше1твН); 2:

тип 2М Виченца (Vicenza) (мутация рЯ1205Н);

3: Тип 1 (мутация отсутствует);

4: Тип 1 (Мутация р.S1024fa);

5: Тип 1 (мутация отсутствует).

Мутации обнаружены в гетерозиготной форме.

Среди них: использование формалин- и глута-ральдегид-фиксированных тромбоцитов, добавление ристоцетина в концентрации 1 мг/мл, использование трех различных разбавлений испытуемого образца, дополнительной калибровочной кривой, калибровки местного стандарта по сравнению с международными эталонными контрольными препаратами (с использованием ФфВ-дефицитной плазмы для разбавления в кривых «доза-ответ», если в анализ включена лиофи-лизированная плазма). Среди других условий: продолжительность анализа не должна превышать 2-х часов, с включением в анализ контроля плазмы с высоким и низким содержанием ФфВ в каждом анализе [3].

Перечисленные трудности при проведении теста нередко встречаются даже в специализированных лабораториях [4]. Поэтому для замены ФфВ^йз был предложен ряд других тестов, включая коллаген-связывающую активность или иммунотурбидиметри-ческие методы для ФфВ^йз. Тем не менее ни один тест нельзя однозначно рекомендовать вместо основанного на взаимодействии тромбоцитов ФфВ^йз. Однако следует иметь в виду, что ристоцетин не является физиологическим компонентом системы свертывания и, таким образом, даже классический тест на ристоцетин-кофакторную активность представляет собой лишь искусственное моделирование функций ФфВ, наблюдаемых in vivo.

Для решения обозначенных выше проблем недавно был разработан новый анализ. Тест-система на основе ИФА исследует взаимодействие «ФфВ — GPIb» с использованием рекомбинантного белка с генетически модифицированного гена GPIb (GPIba235Y, 239V), содержащего две естественные мутации, которые вызывают БВ тромбоцитарного типа (PT-БВ) [5]. Наличие этих мутаций усиливает связывание глико-протеина Ib с его молекулами-партнерами. Действительно, PT-БВ — это наследственное нарушение функции тромбоцитов, вызываемое мутациями в GPIb, которые обуславливают спонтанное усиление взаимодействия с ФфВ и приводят к тромбоцитопении [6]. Таким образом, используемая генетическая конструкция имитирует БВ типа 2B — с тем лишь отличием, что в последнем случае описанные выше мутации находятся в домене Al ФфВ [7]. С помощью этого анализа на всех типах БВ были получены результаты, аналогичные данным классического теста ФфВ^о. Исключение составили лишь пациенты с БВ типа 2В, которые показали повышенные результаты в соотношении тестов ИФА / ФфВ:Аг из-за того, что у большинства пациентов нормальные уровни в ходе анализа были измерены на основе ИФА [5]. Этот результат демонстрирует то, что в ходе нового теста можно эффективно отделить пациентов с БВ типом 2А от типа 2B, в ряде случаев дополнительно демонстрируя аномальную природу молекул ФфВ (например, отсутствие мультимеров с высокой молекулярной массой).

В настоящем исследовании Lawrie и соавт. использовали новый метод в формате автоматизированного иммунотурбидиметрического теста, разработанного компанией Siemens Healthcare Diagnostics. Реагенты поставляются в жидком виде, в анализе используются полистирольные микрогранулы, покрытые антителами к GPIb. После добавления рекомбинантного GPIba235Y.239V человека этот белок связы-

вается с антителами на полистирольных гранулах с одной стороны и с молекулами ФфВ из исследуемого образца с другой. Данное взаимодействие вызывает «склеивание» гранул между собой и изменение физических свойств образца, по которым и определяют результат теста. Каждый образец был проанализирован в двух различных разведениях; данные показали хорошую корреляцию с классическим тестом (rs = 0,99, Р <0,0001). Аналогично, нормальные контрольные и испытуемые клинические образцы показали хорошую корреляцию между ФфВ^Оз и ФфВ^, характеризуясь лишь незначительной погрешностью. Более высокая чувствительность метода к низким уровням ФфВ:Ас по сравнению с классическим тестом ФфВ^Оз позволила успешно измерить активность ффВ:Ас в тех 17 образцах БВ, где активность была ниже предела чувствительности классического ФфВ:РКо. Как следствие, соотношение ФфВ:Ac к ффВ:Аг, выявленное с помощью этой новой методики, является более надежным.

В заключение стоит отметить, что новый анализ на основе ИФА, описанный в работе Lawrie и соавт., является надежным и точным методом, с улучшенной чувствительностью к низким концентрациям ФфВ по сравнению с классическим анализом ФфВ^Оз. В основе предлагаемого теста лежит простая и понятная методология, что делает его удобным для использования в лабораториях с ограниченным опытом диагностики болезни фон Виллебранда. Тем не менее, необходимы дополнительные данные по поведению этой новой тест-системы в различных ситуациях (например, мониторинг влияния десмопрессина [DDAVP] или ответа на введение концентратов ФVШ/ффВ) прежде чем рекомендовать данный тест для повсеместного использования.

Литература:

1. Macfarlane DE, Stibbe J, Kirby EP er al. A method for assaying von Wiliebrand factor (ristocetin cofactor). Thromb Diath Haemorrh 1975; 34: 306-308.

2. Gangarosa EJ, Johnson TR, Ramos HS. Ristocetin-induced thrombocytopenia: site and mechanism of action. Arch Intern Med I960; 105:83-89.

3. Rodeghiero F, Castaman G. Calibration of lyophi-lized standards for ristocetin cofactor activity of von Willebrand Factor (vWF) requires vWF-deficient plasma as diluent for dose-response curves. Thromb Haemost 1987; 58: 978-981.

4. Lee CA, Hubbard A, Sabin CA et ah, 15th SSC Subcommittee on ФфВ. Laboratory diagnosis of von Wiliebrand disease: results from a prospective and blind study in 32 laboratories worldwide using lyophilized plasmas. J Thromb Haemost 2011; 91: 220-222.

5. Flood VH, Gill JC, Morateck PA etal. Gain-of-function GPIb ELISA assay for ФфВ activity in the Zi m-merman Program for the Molecular and Clinical Biology of VWD. Blood 2011; 117: e67-74.

6. Othman M. Platelet-type von Wiliebrand disease: a rare, often misdiagnosed and underdiagnosed bleeding disorder. Semin Thromb Hemost 2011; 37: 464-469.

7. Federici AB, Mannucci PM, Castaman G et al. Clinical and molecular predictors of thrombocytopenia and risk of bleeding in patients with von Wiliebrand disease type 2B: a cohort study of 67 patients. Blood 2009; 113: 526-534.

Тужырым

ВИЛЛЕБРАНД ФАКТОРЫН ТАЛДАУ YШIН РИСТОЦЕТИН: ОЛ Б1ЗГЕ КЕРЕК ПЕ?

Ристоцетин-кофакторлы талдау (ФфВ:RCo) Виллебранд (ВА) ауруын диагностикалау кезiндегi Виллебранд фоны факторыныч (ФфВ) белсендiлiгiн багалау Yшiн негiзгi 8дiс болып табылады. Алайда, осы талдау ФфВ темен дечгей кезiнде жаман кайта ендiрумен ж8не кiшкене сезiмталдылыкпен ерекшеленедi ж8не кеп еибектi кажет ететiн болып табылады. Осы ечбекте Lawrie авторластарымен ФфВ белсендiлiгiн аныктау Yшiн жача иммунотурбидиметриялык талдаудыч енiмдiлiгiн багалады (INNOVANCE® VWFAc., Siemens Healthcare Diagnostics, Марбург, Германия). Осы талдауда ристоцетин мен тромбоциттер колданылмайды ж8не ФфВ GPIb байланыстыруды жаксартушы жасанды енгiзiлген мутациялармен тромбоците^ ч рекомбинантты гликопротеин Ib (GPIb) фрагменттфмен ауыстырылган.

Талдауда 50 калыпты бакылау Yлгiлерi, ВА -мен 80 пациент каныныч Yлгiлерi ж8не гемолиздщ, сарыаурудыч немесе липемияныч нышандарымен 50 Yлгi колданылган, оларды ФфВ^Со тестУч тромбоциттерiне негiзделген классикалык деректермен салыстырылды. ФфВ:РСо н8тижелерiмен корреляция канагаттанарлык болды, сол сиякты ФфВ:Ас ж8не ФфВ:РСо ФфВ:Аг есептелген ара катынасы ретЫде. Алайда ФфВ айкындау шегi: ФфВ:РСо -пен салыстырганда Ас темен болды (тиганше 3 Бiрл/vз ж8не 5 Брл/уз).

Авторлар ФфВ темен концентрациясы кезiнде ФфВ:РСо караганда жача талдау сенiмдi ж8не сезiмталдырак болып табылады деген корытындыга келдi. Талдау мамандандырылган емес зертханаларда еткiзу Yшiн карапайым ж8не кеп ечбект кажет етпейтЫ болып табылады.

Heri3ri сездер: Ристоцетин-кофакторлы талдау, иммунотурбидиметриялык талдау, кан Yлгiлерi, эксперимент.

Summary

Ristocetinum for analysis of von Willebrand factor: Do we actually need it?

Ristocetinum — cofactor analysis (R:Co) is the main method for estimation of von Willebrand factor activity at diagnostic of Willebrand diseases (WD). Nevertheless, this analysis is distinct with bad reproducibility and low sensibility at low rates of FWV and it is considerably time-consuming. In this paper, Lawrie and coauthor have evaluated the productivity of new im-muno-turbidimetric analysis to define activity of FWV (INNOVANCE® VWF Ac., Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Germany). In this analysis ristocetinum and thrombocytes are not use and changed with fragment of recombinant glycoprotein of thrombocytes lb (GPlb) with affectedly impregnate mutations ameliorative fixation FWV and GPlp.

There were use 50 standard control samples, blood samples of 80 WD patients and 50 with erythrocatalysis, icterus and hiperlipoidemia evidences which were compared with data of classic FWV:RCo test, rest on thrombocytes. Results correlation of FWV:RCo was satisfactory as well as calculated quotient of FWV:Ac and FWV:RCo to FWV:Ar Nonetheless, detection limit of FWV:Ac was lower than FWV:RCo (3cl/lg and 5cl/lg) properly.

Authors reason that new analysis is sure and more sensitive than FWV:RCo at low concentration of FWV. Analysis is simple and less difficult for carrying out at unspecialized laboratories.

Key words: Ristocetinum — cofactor analysis, immuno-turbidimetric analysis, blood samples, experiment.

УДК 612.42-616-097-612.014.482.1

М.Р. Мадиева, А.К. Мусайнова, Б.А. Жетписбаев, С.Е. Узбекова, Х.С. Жетписбаева

Государственный медицинский университет города Семей

ИЗМЕНЕНИЯ СОСТОЯНИЙ ЛИМФОИДНЫХ ОРГАНОВ ИММУНОГЕНЕЗА В ПОЗДНЕМ ПЕРИОДЕ ПОСЛЕ ДЕЙСТВИЯ ФРАКЦИОНИРОВАННОЙ ДОЗЫ ГАММА-ИЗЛУЧЕНИЯ

Аннотация

В отдаленном периоде после общего фракционированного гамма-излучения сниженными остаются масса и число тимоцитов в тимусе, лимфоидных клеток в лимфатических узлах тонкого кишечника.

Ключевые слова: фракционированное гамма-излучение, тимоциты, лимфоидные клетки.

Лимфоидные клетки, с которыми связаны все иммунные механизмы организма, появляются, созревают и функционируют в определенных органах иммунной системы. В свою очередь они делятся на два типа: первичные (центральные) и вторичные (периферические). В центральных лимфоидных органах иммуногенеза созревание лимфоцитов происходит без существенного влияния антигенов, в то время периферические лимфоидные органы зависят от антигенного воздействия. В центральных лимфоидных органах иммуногенеза — костный мозг, тимус и сумка Фабрициуса происходит дифференцировка определенных популяций лимфоцитов: тимус представляет собой тимусза-висимые, или Т-лимфоциты, а в сумке Фабрициуса образуются В-лимфоциты. После рождения костный

мозг становится основным источником стволовых клеток [1,2].

Периферическими лимфоидными органами следует считать селезенку, лимфатические узлы, миндалины, а также ассоциированную с кишечником и бронхами лимфоидную ткань. Периферические органы иммунной системы заселяются Т- и В-лимфоцитами из центральных органов, при этом каждая популяция лимфоцитов мигрирует в определенные области периферических органов, которые называются тимусза-висимыми и тимуснезависимыми зонами [1-4].

Источник: cyberleninka.ru

Агрегация тромбоцитов – что это такое?

Прежде, чем преступить к разбору данного термина, следует понять – что же такое тромбоциты. Эти клетки образуются в костном мозге, затем попадают в кровеносное русло. Являются самыми мелкими клетками в крови, их диаметр не превышает 3 микрон. Лишены ядра.

Тромбоциты ответственны за свёртываемость крови в случае повреждения целостности стенки кровеносного сосуда. После повреждения сосуда клетки начинают активно мигрировать в область поражения. В месте повреждения они активируются, причём процесс является необратимым. В активированной форме клетки прикрепляются к области поражения, а также склеиваются между собой. Причиной активации может являться повреждения сосуда, а также любое изменение внутренней или внешней среды. После агрегации образуется первичная тромбоцитарная пробка, которая останавливает потери крови.

Агрегация тромбоцитов – это необратимый процесс их слипания после перехода в активную форму.

При усилении процесса агрегации у пациента отмечается повышенное тромбообразование. В случае снижения активности происходят избыточные кровопотери. Поэтому агрегация тромбоцитов считается определяющим процессом для полноценного гомеостаза (свёртываемости крови).

В норме при отсутствии внешних воздействий тромбоциты не прикрепляются к стенкам кровеносных сосудов и не склеиваются между собой.

Когда нужно сдать анализ?

Показаниями для исследования выступают:

  • чрезмерная кровоточивость десён;
  • носовые кровотечения;
  • появление геморрагических высыпаний;
  • длительная остановка крови даже при небольших повреждениях сосудов;
  • склонность к образованию синяков;
  • необходимость лечения антиагрегантами и антикоагулянтами;
  • беременность с высоким риском развития гестозов или кровотечения в родах;
  • патологии системы кроветворения.

Исследование обязательно проводится перед хирургическим вмешательством. Низкая степень агрегации тромбоцитов может привести к большим кровопотерям во время операции, что должно быть обязательно учтено.

Анализ обязателен для женщин в положении для оценки функциональной активности тромбоцитов. Результаты исследования помогут подобрать профилактические средства для избыточных кровопотерь во время родов.

Кроме этого, данный показатель определяется при необходимости лечения антиагрегантными лекарствами и антикоагулянтами. Аспирин в небольших дозировках показан людям с атеросклерозом и при патологиях сердечно-сосудистой системы. На основании данных анализа составляются предположительные прогнозы на реакцию организма после приёма аспирина.

Известно, что на агрегацию тромбоцитов влияют также препараты других групп (антибиотики, антигистамины, противовоспалительные средства). Поэтому проведение анализа целесообразно и при планировании приёма данных препаратов.

Читайте далее: Норма тромбоцитов в крови у женщин по возрасту

Как подготовиться к сдаче биоматериала?

Исследование агрегации тромбоцитов проводится строго натощак, с минимальным промежутком после последнего приёма пищи в 6 часов. За 24 часа до визита в лабораторию исключаются: приём алкоголя, спортивные тренировки и психо-эмоциональное перенапряжение. Курение следует отменить на 3 часа до взятия крови.

В случае приёма лекарственных препаратов следует заранее проконсультироваться с врачом. Поскольку лекарственное воздействие существенно изменяет показатель и может привести к получению ложных результатов. Не следует самостоятельно корректировать сроки приёма лекарств и отменять их на своё усмотрение.

Расшифровка анализа крови на агрегацию тромбоцитов

Важно, чтобы расшифровкой полученных данных занимался исключительно лечащий врач. Самостоятельные попытки интерпретации полученных данных могут привести к ошибочным заключениям. Представленная в статье информация может быть использована для ознакомительных целей.

Расшифровка анализа основана на оценке характера агрегации тромбоцитов: полная/неполная, одно- или двухволновая. В качестве стандартных единиц измерения применяются проценты.

Норма показателя при проведении агрегации с:

  • АДФ 0 мкмоль/мл– от 60-ти до 90-та процентов;
  • АДФ 5 мкмоль/мл – от 1.4 до 4.3%;
  • адреналином – от сорока до семидесяти процентов;
  • коллагеном – от пятидесяти до восьмидесяти.

Значение актуально для пациентов обоих полов и любой возрастной категории.

Что может повлиять на показатель?

При обнаружении отклонения показателя от нормы, следует исключить влияние внешних и внутренних факторов. Известно, что курение и повышенное содержание в организме жиров приводят к увеличению процесса агрегации тромбоцитов.

Значительное влияние на тромбоцитарную агрегацию оказывают препараты: аспирина, ингибиторов ЦОГ-1 и ЦОГ-2, нестероидных противовоспалительных средств, антикоагулянтов, цолостазола, дипиридамола, противомикробные средства, сердечно-сосудистые средства, препараты урокиназы, тканевых активаторов плазминогена, пропранолола и т.д.

Следует отметить, что агрегация тромбоцитов не определяется в случае гемолиза взятого биоматериала. Гемолизом обозначается ситуация, когда эритроциты в пробе разрушены, а их содержимое вышло в плазму. Гемолиз возникает при нарушении алгоритма взятия венозной крови, а также при несоблюдении правил хранения и транспортировки биоматериала. В этом случае исследование отменяется и проводится повторное взятие венозной крови.

Методы исследования

Методика определения показателя зависит от лаборатории и типа агрегометра. Достоверность и ценность полученных результатов исследования не зависит от выбранной методики. Наиболее популярные способы – это применение растворов аденозинтрифосфата, ристоцетина, коллагена, адреналина и арахидоновой кислоты. Рассмотрим подробнее суть каждой методики.

Метод с аденозинтрифосфатом

После получения результата анализа пациенты задаются вопросом – что значит агрегация тромбоцитов с АДФ? Расшифровка аббревиатуры АДФ – аденозинтрифосфат. Известно, что небольшое количество АДФ заставляет активироваться тромбоциты с последующим их слипанием. Процесс характеризуется двухволновым течением. Первая стадия агрегации происходит из-за воздействия АДФ. Вторичная волна начинается после высвобождения из тромбоцитов специфичных молекул (агонистов). При добавлении большого количества АДФ (более 1*10-5 моль) зафиксировать разделение двух фаз не представляется возможным, поскольку они сливаются.

При выполнении исследования специалисты обращают особое внимание на количество волн, полноту, скорость и обратимость процесса. Выявление двухволнового процесса при небольших дозах АДФ – признак повышенной чувствительности тромбоцитов. Обратимая и неполная агрегация тромбоцитов с АДФ – 1 указывает на сбои в активации тромбоцитов.

Метод с ристоцетином

Исследование проводится для количественного определения фактора Виллебранда у обследуемого пациента. Это наследственная патология, характеризующаяся нарушениями в процессе свертываемости крови.

Метод основан на прямом воздействии ристоцетина на процесс взаимодействия фактора и гликопротеида. В норме ристоцетин оказывает стимулирующее воздействие на данный процесс. У пациентов с наследственной патологией данный эффект не наблюдается.

Важно провести дифференциальную диагностику, поскольку болезнь Виллебранда схожа с синдромом Бернар-Сулье. Это наследственная патология, на фоне которой тромбоциты у человека полностью утрачивают способность выполнять свои функции. Однако после добавления дефицитного фактора свертываемости крови (при заболевании Виллебранда) слипание тромбоцитов у пациентов восстанавливается. Для синдрома Берна-Сулье подобное восстановление невозможно.

Метод с коллагеном

Отличительная особенность агрегации с коллагеном – длительная латентная фаза, необходимая для активирования фермента фосфолипазы. Продолжительность латентной фазы варьирует от 5 до 7 минут и зависит от концентрации применяемого коллагена.

После завершения этой фазы происходит высвобождение тромбоцитарных гранул и выработка тромбоксана. В результате увеличивается взаимодействие и слипание между тромбоцитами.

Метод с адреналином

Воздействие адреналина на склеивание тромбоцитов схоже с влиянием АДФ. Процесс характеризуется двухстадийностью. Предполагается, что адреналин способен напрямую воздействовать на тромбоциты, повышая проницаемость их клеточной стенки. Что приводит к усилению их чувствительности к высвобождающимся специфическим молекулам.

Метод с арахидоновой кислотой

Кислота является естественным катализатором процесса склеивания клеток. Она не способна напрямую воздействовать на них. Своё воздействие арахидоновая кислота проявляет опосредовано через ферменты, вторичные посредники и ионы кальция.

Процесс агрегации носит стремительный характер, как правило, в одну стадию. Данный вид исследования актуален при приёме пациентом лекарственных препаратов.

Причины отклонения показателя от нормы

Для полного понимания причин отклонения показателя от нормы рассмотрим по отдельности причины для каждого метода.

АДФ более 85%

Завышенные более 85% показатели агрегации с аденозинтрифосфатом фиксируются при:

  • ишемической болезни сердца, при котором происходит сбой в нормальном процессе кровоснабжения сердечного миокарда. Одна из причин патологии – тромбоз артерий. При этом тромбоциты начинают слипаться без воздействия внешних факторов и повреждения сосудов, закупоривая просвет сосудистого русла и нарушая нормальный ток крови (при отрыве тромба развивается инфаркт или ишемический инсульт). После перекрытия 75% просвета артерии у человека отмечается снижение притока к органу крови. Что закономерно становится причиной нехватки поступающего кислорода, гипоксии тканей и атрофии органа. Патология характеризуется хроническим течением и неуклонным прогрессом. Грамотная терапия позволяет замедлить патологическое повреждение миокарда;
  • острая стадия инфаркта миокарда, как одна из клинических форм ишемической болезни сердца. Стадия характеризуется некрозом (отмиранием) целого участка миокарда;
  • синдром гиперкоагуляции крови может носить физиологический характер или развиваться при сочетанных патологиях. Иными словами синдром обозначается как «сгущение крови». Является вариантом нормы для беременных женщин после 2-го триместра. У не беременных женщин и мужчин указывает на развитие патологических процессов;
  • воспаление внутренних органов различной локализации и этиологии.

Причина повышения степени агрегации в пробе с коллагеном или ристомицином (более 85%) – гиперагрегационный синдром.

Агрегация тромбоцитов с адреналином повышена (более 81%) при ишемической болезни сердца, остром инфаркте миокарда, а также на фоне обширных травм и стрессовых перенапряжений.

Снижение АДФ до 65%

Снижение агрегации тромбоцитов после воздействия АДФ до 65% указывает на:

  • тромбоцитопатию – объединяет различные патологии, возникающие из-за невозможности тромбоцитов активироваться и склеиваться, образуя первичный тромб и запуская дальнейший каскад гемостаза. Согласно статистике у каждого двадцатого человека присутствует тромбоцитопатия в различной степени. Заболевание может носить наследственный и приобретенный характер. При этом у пациента отмечается снижение свёртываемости крови, даже при нормальном количестве тромбоцитов;
  • патологии печени или почек, приводящие к нарушению утилизации токсических веществ. Происходит депонирование токсичных веществ, препятствующих нормальной физиологической активности тромбоцитов;
  • нарушения в работе эндокринной системы, в частности, избыточная активность щитовидной железы.

Низкие значения показателя в пробе с адреналином (до 61%) и коллагеном (до 65%) выявляются при тромбоцитопатии и приёме лекарств с противовоспалительной активностью.

Причина снижения показателя в исследовании с ристомицином до 65 % — болезнь Виллебранда.

Выводы

Подводя итог, следует подчеркнуть:

  • исследование на агрегацию тромбоцитов не является рутинным. Оно назначается при подозрении на сбои свёртываемости крови;
  • несмотря на разнообразие методик для анализа, ни одна из них не является достаточной для установления окончательного диагноза;
  • ценность полученных данных возрастает в сочетании с результатами других лабораторных и инструментальных методов диагностики.

Читайте: Как повысить низкие тромбоциты при беременности?

Источник: medseen.ru

Агрегация тромбоцитов с АДФ

Воздействие малых доз АДФ (обычно 1*10-7 моль) приводит к формированию двойной волны агрегации. Первая фаза (первичная волна) зависит от добавленного экзогенного АДФ, а вторая фаза (вторичная волна агрегации) возникает за счет реакции высвобождения собственных агонистов, содержащихся в гранулах тромбоцитов. Большие дозы АДФ (обычно 1*10-5 моль) приводят к слиянию первой и второй волн агрегации.

При анализе агрегатограмм обращают внимание на общий характер агрегации (одноволновая, двухволновая; полная, неполная; обратимая, необратимая) и скорость агрегации. Появление двухволновой агрегации при стимуляции АДФ в концентрациях, вызывающих в норме обратимую агрегацию (обычно 1-5 мкмоль), указывает на повышение чувствительности тромбоцитов, а развитие одноволновой неполной (а часто и обратимой) агрегации при стимуляции АДФ в концентрациях 10 мкмоль и больше – на нарушение реакции высвобождения тромбоцитов.

Агрегация тромбоцитов с ристоцетином

Определение агрегации тромбоцитов с ристоцетином в плазме применяют для количественной оценки фактора Виллебранда. В основе метода лежит способность ристоцетина стимулировать in vitro взаимодействие фактора Виллебранда с тромбоцитарным гликопротеидом Ib. В большинстве случаев болезни Виллебранда отмечается нарушение ристоцетин-агрегации при нормальном ответе на воздействие АДФ, коллагена и адреналина. Нарушение ристоцетин-агрегации выявляют и при болезни Бернара-Сулье. Для дифференциации применяют тест с добавлением нормальной плазмы: при болезни Виллебранда после добавления нормальной плазмы ристоцетин-агрегация нормализуется, в то время как при синдроме Бернара-Сулье этого не происходит. Индуцированная ристоцетином агглютинация тромбоцитов снижена при большинстве случаев болезни Виллебранда, кроме типа IIВ.

Агрегация тромбоцитов с коллагеном

Агрегация тромбоцитов с коллагеном имеет достаточно выраженную латентную фазу, во время которой происходит активация фосфолипазы С. В зависимости от концентрации используемого реагента продолжительность этой фазы может составлять 5-7 минут. После завершения этого периода в тромбоцитах происходят процессы, приводящие к образованию вторичных посредников, вследствие чего развивается секреция тромбоцитарных гранул и синтез тромбоксана А2, что сопровождается резким усилением межтромбоцитарного взаимодействия.

В лабораторно-клинической практике коллаген чаще всего используют в конечной концентрации 50 мкг/мл, однако коллагены разных фирм могут обладать различной активностью, что необходимо учитывать при их применении.

Агрегация тромбоцитов с адреналином

Адреналин при контакте с тромбоцитами взаимодействует с α2-адренорецепторами, что вызывает ингибирование аденилатциклазы. Не исключено, что механизм, лежащий в основе реализации эффекта адреналина и развития первой волны агрегации, не зависит от образования тромбоксана А2, реакции высвобождения или синтеза фактора агрегации тромбоцитов, а связан со способностью адреналина прямо изменять проницаемость клеточной мембраны для ионов кальция. Вторая волна агрегация возникает как результат реакции высвобождения и продукции тромбоксана А2.

Агрегация тромбоцитов с арахидоновой кислотой

Арахидоновая кислота – природный агонист агрегации, причем ее действие опосредовано эффектами простагландинов G2 и H2, тромбоксана А2, и включает активацию как фосфолипазы C с последующим образованием вторичных посредников, мобилизацией внутриклеточного кальция и расширением процесса активации клеток, так и фосфолипазы А2, что непосредственно приводит к освобождению эндогенной арахидоновой кислоты. Агрегация тромбоцитов с арахидоновой кислотой происходит достаточно быстро, поэтому кривая, характеризующая этот процесс, чаще носит одноволновый характер.

Для индукции агрегации кровяных пластинок арахидоновую кислоту используют в концентрациях 10-3-10-4моль. При работе с арахидоновой кислотой следует учитывать, что на воздухе это вещество очень быстро окисляется.

Пробу на агрегацию с арахидоновой кислотой рекомендуют проводить в случаях использования лекарственных средств, влияющих на реакцию агрегации (например, ацетилсалициловая кислота, пенициллин, индометацин, делагил, диуретики), что нужно учитывать при оценке результатов исследований.

Источник: www.cmd-online.ru

Исследование агрегационной способности тромбоцитов

Обследование пациентов с кровотечением требует тщательного анамнеза, в том числе семейного, сведений о приеме лекарственных препаратов, физикального обследования, и только после этого лабораторного исследования.

Количественные и функциональные нарушения тромбоцитов часто встречаются у пациентов с кровотечениями.

Типы нарушений функции тромбоцитов:

Нарушение функции тромбоцитов Вероятный диагноз
Нарушение адгезивной функции тромбоцитов

Синдром Бернара-Сулье

Велокардиофасциальный синдром

Тромбастения Гланцманна

Врожденная афибриногенемия

Болезнь фон Виллебранда (возможно — тромбоцитарный тип болезни фон Виллебранда)

Дефекты рецепторов коллагена

Аномалии тромбоцитарных рецепторов

Дефекты рецепторов TxA2

Дефект α-адренергических рецепторов

Дефект P2Y12 рецепторов
Антитромбоцитарные препараты (например, клопидогрель)

Аномалии тромбоцитарных гранул

Дефицит плотных гранул

— дефицит α-гранул

— синдром серых тромбоцитов

Аномалии секреции содержимого гранул тромбоцитов, либо нарушение передачи сигнала в тромбоцитах Первичные дефекты секреции
Дефекты агрегации, которые аналогичны тем, которые наблюдаются при расстройствах пула хранения тромбоцитов, но с нормальным содержанием гранул и ТхА2
Дефекты агонистов рецепторов на поверхности тромбоцитов
— адреналина
— тромбоксана
— АДФ
— коллагена
Дефекты в активации белка G (дефекты внутриклеточной передачи сигнала)
Нарушение метаболизма арахидоновой кислоты

Дефекты циклооксигеназы

Дефицит тромбоксансинтазы

Прием наркотических препаратов

Нарушение прокоагулянтного механизма тромбоцитов Синдром Скотта
Дефекты цитоскелета тромбоцитов

Расстройства, связанные с MYH9

Синдром Вискотта-Олдрича

До проведения специфических анализов, исследующих функциональные свойства тромбоцитов, рекомендуется выполнить следующие лабораторные тесты:

  1. Общий анализ крови с определения количества тромбоцитов и среднего объема тромбоцитов. Это имеет значение при наследственной макротромбоцитопении (синдроме Бернара-Сулье), микротромбоцитопении (синдроме Вискотта-Олдрича), при некоторых заболеваниях костного мозга.
  2. Изучение мазка крови и морфологии тромбоцитов. Необходимо для установления таких диагнозов, как псевдотромбоцитопения, синдром серых тромбоцитов.  В некоторых случаях, например, при тромбоцитопении Хегглина мазок крови может показать наличие телец Деле (светло-серо-голубых овальных базофильных лейкоцитарных включений, расположенных в периферической цитоплазме нейтрофилов).

Специфические лабораторные тесты для определения функциональных свойств тромбоцитов включают в себя такие обследования как:

— скрининговые тесты, отражающие функциональную активность тромбоцитов, например, активированное время свертывания (АСТ), время кровотечения (ВК) и PFA-100,
— агрегометрия например, классическая агрегометрия по Борну,
— проточная цитометрия для количественной оценки наличия или отсутствия мембранных гликопротеинов тромбоцитов,
— специализированные исследования, применяемые в научно-исследовательских лабораториях.

Принцип метода агрегатометрии по Борну:

Метод измерения агрегации тромбоцитов турбидиметрическим методом по Born (по Борну) основан на регистрации изменений светопропускания в суспензии тромбоцитов. Эти изменения обусловлены снижением светорассеивания и увеличением светопропускания (прозрачности) суспензии в процессе образования тромбоцитарных агрегатов.

В классической агрегометрии по Борну используется плазма, богатая тромбоцитами (БТП). В агрегометре БТП перемешивается в кювете при температуре 37°С. При добавлении агониста образующиеся агрегаты тромбоцитов поглощают меньше света, что регистрируется фотоэлементом.

Ристоцетин это

ОТП – обедненная тромбоцитами плазма, БТП – богатая тромбоцитами плазма.

Наглядно принципы агрегометрии по Борну можно увидеть на анимационной англоязычной презентации, любезно предоставленной авторами научного сайта http://www.platelet-research.org — http://www.platelet-research.org/3/aggregometry.htm.

Преаналитическая вариабельность

Препараты, блокирующие функции тромбоцитов, включают в себя НПВП (нестероидные противовоспалительные препараты), специфические антитромбоцитарные препараты, такие как клопидогрель, а также некоторые антибиотики, антидепрессанты, бета-блокаторы и пр. На функцию тромбоцитов могут влиять также такие продукты, как чеснок, куркума и кофеин, продукты с высоким содержанием жиров (они могут привести к появлению хиломикронов в плазме, что препятствует нормальному светопропусканию в процессе проведения тестирования агрегации тромбоцитов).
Ряд факторов может влиять на правильность результатов агрегации тромбоцитов:

— очень высокое или низкое количество тромбоцитов;

— температура — образцы крови для тестирования агрегации тромбоцитов следует хранить при комнатной температуре;

— рН — агрегацию тромбоцитов следует проводить при физиологическом значении рН;

— концентрация фибриногена.

Агонисты тромбоцитов:

Добавление агониста тромбоцитов к ОТП приводит к активации тромбоцитов, изменению их формы от дискоидной до сферической, которая связана с увеличением оптической плотности в процессе активации тромбоцитов. Единственным исключением из этого являются адреналин  (эпинефрин), который не приводит к изменению формы тромбоцитов, и ристоцетин, который вызывает не агрегацию, а агглютинацию тромбоцитов.

Существуют два типа агонистов:

сильные агонисты — коллаген, тромбин, ТхА2, арахидоновая кислота — непосредственно вызывают агрегацию тромбоцитов, синтез и секрецию ТхА2 гранул тромбоцитов.

слабые агонисты — АДФ и адреналин — вызывают агрегацию тромбоцитов, не вызывая секреции.

Сильные агонисты при низких концентрациях могут действовать как слабые агонисты, но слабые агонисты, даже при высоких концентрациях, не будут действовать в качестве сильных агонистов.

С некоторыми слабыми агонистами (АДФ и адреналин) кривая агрегации тромбоцитов может иметь двухфазный вид — начальную волну агрегации (первичную волну), а затем вторичную волну агрегации, которая, как правило, необратима. При более высоких концентрациях АДФ две волны агрегации сливаются и двухфазный сигнал отсутствует.

Реакция агрегации к агонисту усиливается при высвобождении ТхА2 из фосфолипидов мембран и секреции АДФ из плотных гранул. АДФ и ТхА2 являются агонистами, которые, взаимодействуя с их специфическими рецепторами, усиливают реакцию агрегации тромбоцитов.

Рабочие концентрации используемых агонистов и механизм их действия:

Агонист Рабочая концентрация (С) Механизм действия
АДФ

Низкая –1.0 μM,

2.5 μM,

5.0 μM
Высокая –

10.0 μM

АДФ связывается со своим рецептором на поверхности тромбоцитов. Первоначальное связывание приводит к высвобождению внутриклеточного кальция и изменению формы тромбоцита, ведущее к образованию первичной волны агрегации. Вторичная волна отражает высвобождение АДФ из гранул хранения тромбоцитов. Низкая доза АДФ вызывает лишь первичную агрегацию и ее эффект является обратимым.

АДФ связывается с двумя G-белками рецепторов P2Y1 и P2Y12. Связывание АДФ с рецептором P2Y1 вызывает изменение формы и инициирует агрегацию тромбоцитов (первичную волну) за счет мобилизации кальция. Рецептор P2Y12 считается основным АДФ-рецептором и ответственным за полную агрегацию тромбоцитов через ингибирование аденилциклазы.

Рецептор P2Y12 является также мишенью для клопидогреля. Вторая волна АДФ-индуцированной агрегации подавляется аспирином и НПВС.

Адреналин 5 μM, 10μM Адреналин связывается с α2-адренергическим рецептором на поверхности тромбоцитов, что приводит к ингибированию аденилциклазы и высвобождению ионов кальция. Агрегация тромбоцитов с адреналином визуально аналогична агрегации с АДФ с наличием начальной первичной волной агрегации, высвобождением сохраненного АДФ из тромбоцитов и второй волной необратимой агрегации. Как и с АДФ, эта вторая волна агрегации подавляется аспирином и НПВС. Адреналин,  как и АДФ считается слабым агонистом.
Ристоцетин Низкая –0.5 mg/mL
Высокая –1.5 mg/mL,5 mg/mL
Ристоцетин в высоких концентрациях вызывает агглютинацию тромбоцитов через фактор Виллебранда и комплекс GPIb-IX-V.
Коллаген 1, 4μg/mL

Коллаген связывается с рецепторами GРVI и GРIa / IIa, индуцируя высвобождение содержимого гранул, пул TXA2, а затем приводит к устойчивой активации GPIIb-IIIa.Рецептор GРIa / IIa участвует в адгезии тромбоцитов. Рецептор GРVI участвует в передаче сигналов тромбоцитов и генерации TхA2.

Лаг-фаза формируется после добавления коллагена к ОТП обычно меньше, чем за 1 мин. 

Арахидоно-вая кислота 500μg/mL Арахидоновая кислота является предшественником TхA2 в тромбоцитах. Арахидоновая кислота превращается в TхA2 при участии циклооксигеназы и тромбоксан-синтетазы. ТхА2 является мощным индуктором агрегации тромбоцитов, вызывая высвобождение гранул, образование еще большей генерации TхA2 и затем устойчивой активации рецепторов GРIIb-IIIа.
Тромбин

Низкая –50 nmol/L

Высокая –

100 nmol/L

Тромбин является самым мощным физиологическим активатором тромбоцитов, действующим на рецепторы PAR1 и PAR4.Тромбин вызывает агрегацию тромбоцитов даже при низких концентрациях, это не приводит к полной агрегации, однако при меняет форму тромбоцитов. При более высокой концентрации тромбин индуцирует полную агрегацию тромбоцитов.

 

Используемая аббревиатура: БТП – бедная (обедненная) тромбоцитами плазма, ОТП – обогащенная тромбоцитами плазма, TхA2 — тромбоксан А2, С – концентрация, GP – гликопротеид.

Вид классической двухфазной кривой агрегации тромбоцитов:

Ристоцетин это

При введении адреналина и низких доз АДФ обычно образуется двухфазная кривая агрегации, в то время как при введении других агонистов, либо при высоких концентрациях индукторов, возможно слияние первой и второй волн. При двухфазной агрегации вторая волна связана с реакцией высвобождения гранул тромбоцитов.

Параметры агрегатограммы.

Ристоцетин это

Основные параметры агрегатограммы можно интерпретировать только после предварительной оценки активности тромбоцитов по типам кривых агрегатограммы (обратимая, двухфазная, необратимая и отсутствие агрегации тромбоцитов).

Основными параметрами агрегатограммы являются интенсивность первичной (Тпа), вторичной (Тва), максимальной агрегации (Тма) и дезагрегации (Тда). О динамике процесса агрегации на графике следует судить по углам наклона кривой агрегатограммы на этапе первичной агрегации (α1), вторичной агрегации (α2) и дезагрегации ). Характеристикой динамики реакции высвобождения эндогенных стимуляторов агрегации тромбоцитов является время латентного периода для коллаген-индуцированной агрегации (tлп) и время начала вторичной агрегации (tва) в норме для двухфазных кривых агрегатограммы (высоких доз АДФ  и адреналина).

Для агрегации, индуцированной коллагеном важно также оценить укорочение или удлинение латентного периода (tлп) по сравнению с величиной этого показателя у здоровых людей.

Качественная оценка агрегатограммы позволяет не только диагностировать гипер- или гипореактивность тромбоцитов, но и предположить причины их возникновения. Для количественной регистрации различных типов агрегатограмм следует вычислять следующие показатели:

— при необратимой агрегации – Тма, Тпа, Тда, Tва, α1, α2, из которых самыми информативными являются Тва, α2 и Tва;

— при обратимой агрегации – Тма и Тда.

Диапазон колебаний основных показателей агрегатограммы:

Параметры агрегатограммы Диапазон изменений Параметры агрегатограммы Диапазон изменений
Тма 30-50% Tва 30-45 с
Тва 30-40% α1 60-75 º
Тда 60-80% (от величины Тпа) α2 60-75 º
Тпа 10-20% β 30-45 º
tлп 25-30 с  

Референсные значения

Агрегационная активность в норме составляет при использовании индукторов:

  • Агрегация тромбоцитов с АДФ (5,0 мкмоль/мл): 60-90%
  • Агрегация тромбоцитов с АДФ (0,5 мкмоль/мл): 1,4-4,3%
  • Агрегация тромбоцитов с адреналином: 40-70%
  • Агрегация тромбоцитов с коллагеном: 50-80%

Интерпретация данных

Ориентировочный диагноз Изменения на агрегатограмме
Тромбастения Гланцманна или афибриногенемия Отсутствие или значительное снижение агрегации при стимуляции любыми агонистами, кроме ристоцетина
Синдром Бернара-Сулье или болезнь фон Виллебранда Отсутствие или значительное снижение агрегации с ристоцетином
Нарушение пула хранения Первичная волна агрегации только с АДФ, адреналином и коллагеном.
Действие аспирина или аспириноподобный эффект Отсутствие агрегации с арахидоновой кислотой. Присутствие первичной волны только с АДФ. Снижение или отсутствие агрегации с коллагеном.
Действие клопидогреля Отсутствие агрегации с АДФ
2В тип болезни фон Виллебранда (БВ) или тромбоцитарный тип БВ Агрегация с низкой дозой ристоцетина (0,5 мг/мл)

 

Ссылка на методическое пособие «Клинико-лабораторная диагностика нарушений функции тромбоцитов». Васильев С.А., Берковский А.Л., Мелкумян А.Л., Суворов А.В., Мазуров А.В., Козлов А.А. ФГБУ Гематологический научный центр, МЗ РФ, Москва, 2013 г.

 

При подготовке раздела использованы данные научного сайта www.practicalhemostasis.com.

Источник: www.renam.ru


Leave a Comment

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте, как обрабатываются ваши данные комментариев.