Допустимый ph в препаратах из плазмы крови

Препараты крови — лечебные средства, полученные из крови. Выделяют препараты комплексного действия, иммунологически активные (иммуноглобулины) и гемостатические.

К препаратам комплексного действия относят плазму и растворы альбумина; они оказывают одновременно гемодинамическое, противошоковое действие. Наибольший эффект вызывает свежезамороженная плазма ввиду практически полной сохранности ее функций. Другие виды плазмы — нативная (жидкая), лиофилизированная (сухая) — в значительной мере теряют лечебные свойства в процессе изготовления, и их клиническое использование менее эффективно. Свежезамороженную плазму получают методом плазмафереза (см. Плазмаферез, цитаферез) или центрифугирования цельной крови с быстрым последующим замораживанием (в первые 1—2 ч с момента взятия крови у донора). Она может храниться до 1 года при 1°—25° и ниже. В течение этого времени в ней сохраняются все факторы свертывания крови, антикоагулянты, компоненты системы фибринолиза.

посредственно перед переливанием свежезамороженную оттаивают в воде при t° 35—37° (для ускорения оттаивания плазмы пластикатный мешок, в котором она заморожена, можно разминать в теплой воде руками). Переливать плазму следует сразу после согревания в течение первого часа в соответствии с прилагаемой инструкцией по применению. В оттаявшей плазме могут появиться хлопья фибрина, что не препятствует переливанию ее через стандартные пластикатные системы, имеющие фильтры. Значительное помутнение, наличие массивных сгустков свидетельствуют о недоброкачественности плазмы: в этом случае переливать ее нельзя.

Повторное замораживание и оттаивание плазмы не допускается. Переливаемая больному свежезамороженная плазма должна быть одной группы с кровью больного по системе АВ0. В экстренных случаях при отсутствии одногрупповой плазмы допускается переливание плазмы группы А(II) больным с группой крови 0(I), плазмы группы В(III) больным с группой крови 0(I) и плазмы группы АВ(IV) — больным с любой группой крови; проба на групповую совместимость не проводится. Трансфузии свежезамороженной плазмы показаны при тромбогеморрагическом синдроме, ожоговой болезни, гнойно-септических процессах, синдроме длительного сдавления, а также при геморрагических диатезах, обусловленных дефицитом плазменных факторов свертывания крови, в т. ч. при гемофилиях А и В, массивной кровопотере (при потере крови свыше 25% объема переливание свежезамороженной плазмы сочетают с переливанием эритроцитной массы, лучше отмытых эритроцитов) и др. Свежезамороженную плазму применяют также у больных с рецидивирующими тромбозами кровеносных сосудов, особенно обусловленными дефицитом естественных антикоагулянтов (антитромбина III, белков С и S и др.), на фоне гепаринотерапии и применения фибринолитических препаратов (например, стрептокиназы).

Ее переливают с реологически активными препаратами (например, реополиглюкином) при нарушениях лимфоциркуляции. При гемофилии трансфузии свежезамороженной плазмы проводят в случае отсутствия концентрата VIII фактора свертывания крови (криопреципитата) по 300—500 мл 3—4 раза в сутки. При тромбогеморрагическом синдроме суточная доза свежезамороженной плазмы составляет 1—2 л и более, вводят также капельно гепарин в малых дозах (до 20 000 ЕД в сутки) и контрикал в больших количествах (до 60 000 ЕД в сутки).

Переливание свежезамороженной плазмы нескольким больным из одного пластикатного мешка или флакона запрещается; нельзя также оставлять ее для последующих переливаний после разгерметизации пластикатного мешка или флакона. Переливание свежезамороженной плазмы противопоказано больным, сенсибилизированным к парентеральному введению белка. Для профилактики патологических реакций проводят биологическую пробу, как и при переливании цельной крови.

Альбумин выпускают в виде 5, 10 и 20% раствора. Наряду с очищенным альбумином широко применяют препарат «протеин», содержащий примеси a- и b-глобулинов. Благодаря введению стабилизаторов растворы альбумина выдерживают пастеризацию, инактивирующую вирусы гепатита и ВИЧ-инфекции.

ьбумин показан при различных видах шока — травматическом, операционном, ожоговом, а также при отеках, обусловленных нарушениями белкового состава крови, при нарушениях синтеза альбумина в печени и его большой потере (например, при циррозе печени, асците, ожогах). Концентрированные растворы альбумина применяют в тех случаях, когда необходимо ограничить объем вводимой в организм жидкости, например при черепно-мозговой травме, сопровождающейся отеком головного мозга, сердечной недостаточности. Альбумин (5% раствор) целесообразно использовать при кровопотере, когда необходимо нормализовать АД. При массивных кровотечениях введение альбумина следует сочетать с трансфузиями эритроцитной массы. Альбумин в виде 10% раствора применяют обычно в педиатрической практике.

Иммуноглобулины плазмы, выделяемые при фракционировании крови, составляют группу иммунологических препаратов, обладающих специфической активностью против инфекционных болезней В клинической практике наиболее широко используют нормальный иммуноглобулин человека (гамма-глобулин). Высоким лечебным эффектом обладают специфические иммунные препараты направленного действия против гриппа, клещевого энцефалита, столбняка и др. Высокочувствительный иммуноглобулин применяют в терапии идиопатической тромбоцитопенической пурпуры. Препараты иммуноглобулинов вводят внутримышечно. Очищенные иммуноглобулины, пригодные для внутривенного применения, намного эффективнее в связи с тем, что попадая непосредственно в кровяное русло, белок не подвергается расщеплению тканевыми протеазами.

К гемостатическим препаратам относятся криопреципитат, протромбиновый комплекс, фибриноген. В криопреципитате содержатся в большом количестве антигемофильный глобулин (VIII фактор свертывания крови) и фактор Виллебранда, а также фибриноген, фибринстабилизирующий фактор XIII и примеси других белков. Препараты выпускают в пластикатных мешках или во флаконах в замороженном или высушенном виде. Применяют их при гемофилии А, болезни Виллебранда и некоторых других видах кровоточивости.

При гемофилии В, геморрагической болезни новорожденных и передозировке антикоагулянтов непрямого действия (пелентана, фенилина) используют протромбиновый комплекс (PPSB, или КСФ) — комплекс II, VII, IX и Х факторов свертывания крови; при его отсутствии вводят внутривенно свежезамороженную плазму.

Фибриноген имеет ограниченное применение: он показан при кровотечениях, вызванных дефицитом фибриногена. При гипофибриногенемии, обусловленной тромбогеморрагическим синдромом, его замещение, как и других факторов свертывания крови, следует проводить свежезамороженной плазмой, поскольку очищенный фибриноген не сбалансирован с естественными антикоагулянтами и может подвергнуться в кровяном русле больного свертыванию, что усиливает легочную и почечную недостаточность В свежезамороженной плазме содержится достаточно фибриногена, чтобы восполнить его дефицит в организме.

Помимо препаратов, вводимых внутривенно, существует группа гемостатических средств, применяемых местно для остановки наружных кровотечений, возникающих при оперативных вмешательствах. К ним относятся тромбин, фибринная пленка, гемостатическая губка, биологический антисептический тампон и др. Основным действующим началом этих средств является тромбин, вызывающий образование сгустка в результате превращения фибриногена К в фибрин, который тромбирует просвет кровеносных сосудов в месте кровотечения. Особенно эффективно применение препаратов для гемостаза на поврежденной поверхности паренхиматозных органов.

Фибринные пленки и губки в силу своих механических свойств используются не только для остановки кровотечения, но и как пластический материал, например при лечении ожоговой болезни, трофических язв. В нейрохирургической практике фибринные пленки с успехом применяются для замещения дефицита твердой мозговой оболочки. Изогенные пленки могут быть оставлены при оперативном вмешательстве в организме больного, что невозможно при применении гетерогенного препарата из-за угрозы сенсибилизации организма чужеродным белком.

Источник: Nedug.Ru

Источник: GMPnews.ru

Для чего нужно знать этот показатель

Не каждый человек понимает, что это такое — кислотность крови. Ученые из Дании в начале прошлого столетия впервые ввели понятие Ph. Они разработали линейку кислотности от 0 до 14 единиц. По ней для любой жидкости, в т. ч. крови, определяется показатель Ph.

Среднее значение шкалы составляет 7 единиц и означает нейтральную среду. При величине менее 7 среда кислая, более 7 – щелочная. Кислотно-щелочной уровень любой жидкости зависит от количества сконцентрированных в ней частиц водорода.

Кислотность крови (или уровень Ph) – величина постоянная. Она влияет на окислительно-восстановительные процессы в человеческом организме, обмен веществ, активность ферментов. Для сохранения ее стабильности в организме действуют буферные системы, контролирующие уровень ионов водорода и препятствующие резким перепадам кислотности.

Буферные системы подразделяются на:

бикарбонатную;
фосфатную;
белковую;
гемоглобиновую;
и эритроциты.

Нормы кислотности

У здорового человека нормальный Ph держится в диапазоне 7,32–7,45, что указывает на слабощелочную реакцию крови.

Данное значение свидетельствует, что концентрация ионов водорода соответствует норме и все системы организма функционирует на должном уровне.

Уровень кислотности несколько различается для артериальной и венозной крови. В первом случае его нормальное значение — 7,37– 7,45, во втором — 7,32–7,42 единиц.

Если значение Ph менее 6,8 и более 7,8, то это свидетельствует о развитии патологических процессов в организме. Кислотно-щелочной баланс нарушается и в результате заболеваний, влияющих на кровообращение.

Только при нормальном значении водородного показателя все системы и органы могут нормально функционировать, удалять отработанные продукты обмена.

Анализ крови на кислотность и подготовка к нему

Он необходим для постановки точного диагноза при отдельных расстройствах. Условно этот анализ называется «Показатели кислотно-щелочного равновесия». Осуществляют забор из капилляров пальца артериальной крови, которая чище венозной, а соотношение клеточных структур и плазмы в ней практически стабильное.

Для получения достоверных результатов необходима правильная подготовка. Чтобы узнать уровень Ph, необходимо за 8 часов до сдачи отказаться от употребления пищи, так как кровь сдается на голодный желудок, в утренние часы.

Определение показателя кислотности в лаборатории

После забора материала проба доставляется в лабораторию. Для того чтобы замедлить обмен веществ, так как это влияет на достоверность результата, из пробирки удаляют пузырьки газа, а ее помещают в лед.

По полученным данным резюмируют:

если значение на уровне 7,4 единиц – слабощелочная реакция, кислотность нормальная;
если показатель превышает 7,45, то имеется защелачивание организма, когда системы, ответственные за переработку, не справляются со своими функциями;
если значение ниже нормы (7,4) – повышена кислотность, что означает либо ее излишнее накопление, либо не способность буферных систем обезвредить эти излишки.

Любое отклонение вредно для организма и требует более детального обследования человека и назначения должного лечения.

Алкалоз и его причины

Алкалоз, или защелачивание крови, — заболевание, встречающееся нечасто и возникающее из-за большой потери кислоты в организме или по причине накопления щелочи. Значительное снижение кислоты возможно из-за частой и длительной рвоты (например, при отравлении) либо нарушения отдельных функций почек, ответственных за регуляцию кислотного равновесия.

Выделяют два типа алкалоза:

газовый, который развивается из-за повышенной отдачи легкими углекислого газа (гипервентиляция, постоянное нахождение на большой высоте – высотная болезнь);
не газовый, который возникает при высоких щелочных резервах (поступлении большого количества щелочи с пищей, нарушение обмена веществ).

Основные причины, приводящие к снижению кислоты:

излишнее употребление пищи с большим содержанием щелочи (это зеленый чай, молоко и продукты на его основе);
излишний вес, переходящий в ожирение;
наличие сердечно-сосудистых болезней;
нервный срыв, эмоциональное перенапряжение;
прием некоторых лекарственных препаратов, приводящих к сбою щелочного равновесия.

При алкалозе нарушаются процессы обмена, ухудшается пищеварительная деятельность, из желудочно-кишечной системы в кровь попадают токсины. Эти отклонения провоцируют развитие заболеваний печени, ЖКТ, появляются проблемы с кожей, аллергические реакции.

Ацидоз и его причины

Ацидоз — это повышение кислотности крови. Встречается значительно чаще, чем алкалоз, из-за предрасположенности человеческого организма к окислению. Из-за дисфункции в каких-либо системах организма, приводящих к затруднению выведения органических кислот, происходит их накопление в крови, вызывая кислую реакцию.

Ацидоз подразделяется на три вида:

газовый – появляется при замедленном выведении легкими углекислого газа;
не газовый – развивается из-за накопления в организме продуктов метаболизма либо их проникновения из ЖКТ;
первичный ренальный – возможен в результате нарушения некоторых функций почек, вызванных большой потерей щелочи.

Незначительное изменение кислотности никаким образом не проявляется, протекает бессимптомно. При тяжелой форме наблюдается учащенное дыхание, тошнота, приводящая к рвоте.

Причинами, вызывающими подобное состояние, являются:

расстройство кишечника, затянувшаяся диарея;
заболевания мочевыводящих путей;
нарушение кровообращения;
потеря аппетита, отравление, слишком строгая диета (почти голодание);
сахарный диабет;
сердечная недостаточность, приводящая к кислородному голоданию.

Определение кислотности в домашних условиях

Нередко люди, имеющие какие-либо заболевания, интересуются возможностью узнать кислотность крови самостоятельно, не обращаясь в поликлинику. Важно знать, как проверить ее правильно.

Благодаря наличию в аптечной сети специальных портативных приборов и тест-полосок, у каждого имеется возможность узнать кислотно-щелочное равновесие крови самостоятельно в домашних условиях.

Для того чтобы определить Ph дома, можно использовать и тест-полоски. Также необходимо приобрести скарификаторы для прокола пальца и соблюсти несложные рекомендации:

проколоть палец;
выдавить каплю крови в емкость или медицинскую пробирку, что предпочтительнее;
опустить в кровь тест-полоску, оставить там на несколько секунд.

Полученный результат следует сравнить со шкалой, нанесенной на упаковку, выбрать подходящий цвет и определить у себя норму или отклонение показателя.

Способы нормализации кислотности

Восстановить баланс кислоты и щелочи самостоятельно при патологическом состоянии организма невозможно. Но понизить кислотность или поднять реально при соблюдении диеты, приема медикаментов по назначению врача.

Питание

Правильный рацион и потребление достаточного количества жидкости помогут предупредить начальные проявления дисбаланса.

Продукты, повышающие уровень кислоты:

сахар, сахарозаменители, сладкие напитки, в т. ч. с газом;
бобовые, большинство злаковых культур;
морепродукты, рыба;
изделия из муки, особенно пшеничной;
яйца, поваренная соль;
молоко и молочная продукция;
мясо и еда на его основе;
табачные изделия, алкогольные напитки, включая пиво.

Постоянное употребление данных продуктов провоцирует падение иммунитета, развитие гастрита и панкреатита. Повышенная кислотность у мужчин увеличивает риск возникновения импотенции и бесплодия, так как сперматозоиды погибают в кислой среде. Негативным образом увеличение кислоты сказывается и на женской репродуктивной функции.

Продукты, увеличивающие содержание щелочи:

фрукты (персик, манго, цитрусовые, дыня, арбуз и т. д.);
пряные травы (петрушка, шпинат);
чеснок, имбирь;
овощные соки.

Специалисты рекомендуют включать в меню продукты, уравновешивающие Ph крови: листовой салат, орехи, воду.

Для соблюдения баланса некоторые доктора советуют пить щелочную минеральную воду. Один стакан воды нужно употребить утром, а в течение дня выпить еще два-три. Такую воду можно использовать для заваривания чая или кофе, приготовления еды. Но ею не следует запивать лекарственные препараты, так как она способна снизить их эффективность.

Как лечиться

Если при сдаче анализа выявлена высокая кислотность либо защелачивание крови, то в первую очередь выясняют причины, вызвавшие отклонение. После этого доктор принимает меры, направленные на устранение этих причин, например, назначает терапию сахарного диабета, диареи. Также для нормализации кислотности прописывают инъекции.

Основная профилактика, поддерживающая равновесие, – в меру подвижный образ жизни, правильный рацион (питание предпочтительнее раздельное), употребление достаточного количества жидкости, отказ от вредных привычек (алкоголя, курения).

Источник: prososud.ru

Изобретение относится к области фармацевтической промышленности, а именно к биотехнологии получения гемостатических препаратов. Количественный или функциональный дефицит фактора (Ф) VIII свертывания крови вызывает развитие наследственного геморрагического заболевания гемофилии А, основным методом лечения и профилактики которой является заместительная терапия препаратами Ф VIII.

Ф VIII является гликопротеином плазмы крови, нековалентно связанным с фактором Виллебранда, который существенно повышает стабильность Ф VIII. Ген Ф VIII локализован на Х-хромосоме, и его мутации обуславливают развитие гемофилии А, наследуемой по рецессивному признаку. Активированный Ф VIII (Ф VIIIa) является лабильным, не ферментативным белковым ко-фактором Ф IXa. Ф VIII является необходимым компонентом внутреннего пути свертывания крови (Зубаиров Д.М. Фактор VIII. В: Молекулярные основы свертывания крови и тромбообразования. 2000, Казань, с.101-110).

В заместительной терапии больных гемофилией А и для ее профилактики применяют препараты, содержащие Ф VIII. В настоящее время потребность здравоохранения РФ в препаратах Ф VIII составляет порядка 300 миллионов Международных единиц (ME), но масштабное отечественное промышленное производство в стране отсутствует (Ямкин А.В. и др. Способ получения и свойства препарата VIII фактора свертывания плазмы крови человека // Сибирский мед. журнал, 2009, №2, с.17-20). Получение Ф VIII осуществляется или фракционированием плазмы крови человека или животных, или рекомбинантными методами генной инженерии. Полученные из плазмы крови препараты могут содержать, кроме Ф VIII, фактор Виллебранда, что предполагает их применение при болезни Виллебранда. К проблемам производства препаратов Ф VIII из плазмы крови человека следует отнести:

— возможность инфицирования реципиента вирусами гепатитов (А, В, С), иммунодефицита человека, парвовирусом, сифилисом и другими патогенами,

— возможность переноса реципиенту с определенной группой группы присутствующих в препаратах (концентраты средней чистоты) антител к антигенам эритроцитов других групп крови,

— контаминация препаратов Ф VIII балластными белками,

— стабильность белка Ф VIII в его концентратах (по существующим требованиям Ф VIII должен быть стабилен в течение 12 часов после растворения лиофилизата) (Burnouf Т. Plasma fractionation in the world: current status // Transfus. Clin. Biol., 2007, v.14 (1), p.41-50).

Для решения этих проблем разработаны соответствующие технологические подходы. Так, при подготовке пула плазмы крови проводят отбор тщательно проверенных здоровых доноров, у которых определяют возможное инфицирование вирусами гепатита, иммунодефицита человека и др. Однако для полной гарантии отсутствия вирусной инфекции в процессе получения концентратов антигемофильного фактора осуществляют вирусную инактивацию. В связи с различной природой вирусов (с или без липидной оболочки) инактивацию наиболее часто проводят комплексно, а именно сольвент-детергентами и соответствующим нагреванием (двойная инактивация) (Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products: Annex 4. — WHO Technical Report, Series N24, 2004, p.177).

Для повышения степени очистки получаемых концентратов Ф VIII последовательно используют комплекс процедур фракционирования (преципитацию, различные виды и сочетания высокоэффективных хроматографических методов). Увеличение чистоты препарата обеспечивает повышение его удельной, специфической активности (коагулологическая активность Ф VIII/мг белка) и снижает содержание примесных нежелательных компонентов.

Для повышения стабильности концентратов Ф VIII в процессе его получения применяют удаление белков протромбинового комплекса, добавление альбумина, гепарина, лизина и других веществ.

В настоящее время широко используют следующие препараты Ф VIII из плазмы крови:

Известны следующие способы выделения из плазмы Ф VIII.

Методом, представленным в Патенте РФ №2324495, Ф VIII получали криофракционированием плазмы крови, растворением криопреципитата, вирусной инактивацией криопреципитата сольвент-детергентным методом с применением три-н-бутилфосфата и тритона Х-100, хроматографией на Сефарозе 4FF, ультрафильтрацией и лиофилизацией.

Патент США 5252709 А1 описывает способ получения концентрата Ф VIII, заключающийся в суспендировании криопреципитата плазмы в растворе гепарината натрия, осаждении балластных белков гидроксидом алюминия, стерилизующей фильтрации получаемого супернатанта, вирусной инактивации сольвент-детергентами, адсорбции целевого продукта на хроматографической колонне с Фрактогелем с последующей элюцией буферным раствором, содержащим хлорид натрия, и лиофилизации.

В Патенте США 5259951 А1 препарат Ф VIII получали из плазмы крови криоосаждением и растворением криопреципитата в растворе, содержащем хлорид натрия, гепарин и глицин, очисткой гидроксидом алюминия, нагреванием полупродукта в присутствии стабилизатора, ионообменной хроматографией, диализом преципитата, нагреванием и фильтрационной стерилизацией с последующей лиофилизацией.

В Патенте США 5259951 А1 высокоочищенный Ф VIII плазмы крови получали последовательным применением криопреципитации, растворения криопреципитата в водном растворе, содержащим гепарин, очистки гидроксидом алюминия и полиэтиленгликолем (ПЭГ)-4000, хроматографии на ионообменнике, стабилизации альбумином, гепарином, ПЭГ-4000, лизином и гистидином, концентрирования, диафильтрации, тепловой вирусной инактивации и лиофилизации.

Наиболее близким к заявляемому методу (прототипом) является способ получения Ф VIII, представленным в Патенте РФ 2253475 С1. Способ заключается в получении из плазмы крови человека криопреципитата, который суспендируют в водном растворе гепарина (1-3 МЕ/мл), в очистке от балластных белков гидроксидом алюминия и ПЭГ-4000 (конечные концентрации 0,3% и 2%, соответственно), в вирусной инактивации сольвент-детергентным методом в присутствии Твина, в микрофильтарции, в хроматографическом фракционировании на ДЭАЭ-содержащем носителе с применением буферных (pH 6,75-6,85) растворов различной ионной силы, в стабилизации полученного раствора Ф VIII альбумином (конечная концентрация 0,1%), стерилизации микрофильтрацией, в лиофилизации и в последующей термообработке с целью дополнительной вирусной инактивации. К недостаткам данного метода можно отнести существенную потерю целевого вещества при хроматографическом фракционировании и недостаточную степень очистки выделяемого Ф VIII. На стадии хроматографической очистки выход Ф VIII составлял 40-45%, содержание и удельная специфическая активность фактора VIII были равны 15-20 МЕ/мл и 80-100 МЕ/мг белка, соответственно.

Целью настоящего изобретения является разработка способа промышленного производства стабильного высокоочищенного Ф VIII. Данная цель достигается разработкой технологии, обеспечивающей получение лиофилизированной формы концентрата Ф VIII с высокой специфической удельной активностью за счет повышения степени очистки.

Разработку технологии выделения Ф VIII для получения антигемофильного фактора сначала проводили в лабораторных условиях, а затем масштабировали в условиях опытного производства. Производство препарата Ф VIII соответствовало правилам Хорошей Производственной Практики (GMP), надлежащим правилам промышленной деятельности, стандартным операционным процедурам (СОП) и необходимым условиям стерильности.

На всех стадиях производства исходное сырье, промежуточные продукты и целевой препарат тестируют по активности Ф VIII одностадийным коагулологическим методом и содержанию белка методом Бредфорда. На различных стадиях производства определяют коагулологическую активность фактора Виллебранда и протромбина, содержание фибронектина измеряют твердофазным иммуноферментным методом. На уровне промышленного производства строго контролируют степень микробного инфицирования.

Сырьем для получения Ф VIII является свежезамороженная плазма донорской крови с активностью Ф VIII не менее 0,7 МЕ/мл. Необходимое условие использования плазмы заключается в доказанном отсутствии ее инфицирования вирусами гепатитов В и С и иммунодефицита ВИЧ 1/ВИЧ 2. В процессе очистки Ф VIII на стадии осаждения применяют комбинацию полиэтиленгликоля (ПЭГ)-4000 (Merck, Германия) и гидроксида алюминия (Biosector, Дания). Для проведения вирусной инактивации используют 1% раствор Твин 80 и 0,03% три-n-бутилфосфат (Merck, Германия). Анионообменную хроматографию проводят на сильных анионообменниках группы ТМАЕ, не содержащих ДЭАЭ, предпочтительно EMD-TMAE Fractogel (Merck, Германия), с использованием хроматографической колонны Millipore Vantage S2 и хроматографа BioProcess (GE, США). Концентрацию ионов натрия определяли на ионном анализаторе (CIBA-CORNING, США). Стерильную фильтрацию препарата осуществляют с помощью фильтров 0,22 мкм (Millipore, США), а лиофилизацию — на аппарате SERAIL (Франция) по специально разработанному режиму.

Заявляемый способ получения Ф VIII состоит из следующих стадий:

1. Из свежезамороженной плазмы крови человека методом контролируемого оттаивания и центрифугирования выделяют криопреципитат (КП) (отделяемый криосупернатант используют как сырье для получения Ф IX, альбумина и иммуноглобулинов).

2. Полученный КП солюбилизируют с последующей корректировкой pH. Для повышения степени очистки целевого Ф VIII используют водный раствор, содержащий 5-100 международных единиц (ME) нефракционированного гепарина в 1 мл, предпочтительно 10-25 МЕ/мл.

3. Солюбилизированный КП обрабатывают гелем гидроксида алюминия, интенсивно сорбирующим при нейтральных pH факторы протромбинового комплекса. Раствор КП без факторов протромбинового комплекса очищают от фибриногена, фибронектина и других белков с помощью осаждения ПЭГ-4000 и центрифугирования.

Сочетанное применение используемых конечных концентраций гепарина (5-100 МЕ/мл), гидроксида алюминия (0,3%) и ПЭГ-4000 (3,5%) обеспечивает получение промежуточного продукта — очищенного раствора КП — с повышенными стабильностью и удельной специфической активностью Ф VIII за счет более эффективного удаления балластных белков и протеаз. Применение выбранных концентраций гепарина (предпочтительно 10-25 МЕ/мл), величины кислотности (предпочтительно pH=6,6) и конечной концентрации ПЭГ-4000 (3,5%) обеспечивает существенное снижение еще до стадии хроматографической очистки содержания фибриллярного белка фибронектина от 2-4 г/л до 20-30 мг/л (в прототипе — 200-300 мг/л).

4. Очищенный раствор КП подвергают вирусной инактивации с помощью сольвент-детергента (Твин-80 и три-n-бутилфосфат) и предварительной фильтрации с оптимальными условиями вирусной инактивации: нейтральные значения pH (6,9-7,1), температура 25°С и время обработки 6 часов.

5. Дальнейшее выделение (очистку) Ф VIII из раствора вирус-инактивированного КП проводят анионообменной хроматографией (АОХ) с использованием сильных анионообменников, предпочтительно ионоообменник EMD-TMAE Fractogel. Данный тип сорбентов в комбинации с применением оптимальной ионной силы фракционирования позволяет снизить степень адгезивности фактора Виллебранда и повысить стабильность целевого препарата Ф VIII, содержащего фактор Виллебранда. Хроматографическую очистку проводят при размерах колонки — 10×15 см, количестве наносимого образца — 120-200 тысяч ME, стартовом буфере — трис-цитратном солевом с нейтральным pH, элюции — ступенчатым градиентом NaCl и скорости нанесения и элюции — 80-100 см/час.

6. Целевая фракция Ф VIII, полученная на этапе АОХ, имеет удельную активность не менее 140 (150-200) МЕ/мг белка, что существенно (в 1,5-2 раза) превышает удельную активность Ф VIII известных препаратов из плазмы крови. Эту фракцию разводят трис-цитратным буфером с нейтральным pH до требуемой активности Ф VIII, стабилизируют альбумином до конечной концентрации альбумина в препарате 0,1% и проводят стерильную фильтрацию и розлив раствора Ф VIII во флаконы.

7. Разлитый по флаконам раствор Ф VIII лиофильно высушивают и подвергают дополнительной термической вирусной инактивации; потеря активности при термоинактивации не превышает 5%.

После лиофилизации и термической вирусной инактивации в условиях промышленного масштабирования разработанной технологии получают 70-130 флаконов (20 мл) лиофильно высушенного Ф VIII для раствора для инъекций со специфической активностью Ф VIII 200-300 МЕ/флакон со значением выхода специфической активности Ф VIII всего технологического процесса 13-20%.

Ниже представлены конкретные примеры осуществления изобретения.

Пример 1.

1. 180 л Свежезамороженной плазмы доноров, прошедшей аттестацию на наличие инфекций, с активностью Ф VIII, равной 0,75 МЕ/мл (содержание основного продукта 135000 МЕ), размораживают в реакторе при температуре -0,5°С и выделяют криопреципитат (КП) с помощью проточной центрифуги при 1800 об/мин и 3°С. Масса КП составляла 2,0 кг, содержание целевого продукта 80000 ME (выход по целевому продукту 59%).

2. Полученный КП растворяют в водном растворе гепарина (10 МЕ/мл очищенной воды) и солюбилизировают при 25°С. pH Растворенного и солюбилизированного КП корректируют до 6,8. Объем КП 8,0 л, активность целевого на стадии продукта 72000 ME (выход на стадии 90%).

3. Сорбцию факторов протромбинового комплекса осуществляют добавлением к КП 3% геля гидроксида алюминия в количестве, равном 1/10 от массы КП, с перемешиванием при 25°С в течение 15 минут. Осаждение фибриногена, фибринектина и балластных белков проводят добавлением 32% ПЭГ-4000 до конечной концентрации 3,5%. pH доводят до 6,6 и смесь центрифугируют при 4000 об/мин при 2-4°С. Объем целевого супернатанта 8,0 л, активность целевого продукта 70140 ME (выход на стадии 97%).

Эффективность сорбции факторов протромбинового комплекса и удаления примесных белков представлены на рисунке 1 (Сорбция факторов протромбинового комлекса гидоксидом алюминия) и рисунке 2 (Удаление фибриногена ПЭГ-4000), соответственно.

4. Вирусную инактивацию сольвент-детергентным методом проводят добавлением 11% раствора Твин 80 до конечной концентрации 1% с последующим медленным добавлением три-n-бутилфосфата до конечной концентрации 0,3%; pH доводят до 6,8. Вирус-инактивированный полупродукт фильтруют через фильтры Millipore диаметром пор 2-8 мкм. Объем предварительно отфильтрованного раствора составляет 9,0 л, содержание на стадии целевого продукта 69300 ME (выход на стадии 99%).

5. Хроматографическое фракционирование проводят с помощью ионообменника EMD-TMAE Fractogel, стартового, промежуточного и элюирующего буферов с концентрациями ионов натрия 130, 170 и 450 ммоль/л и проводимостью 15, 18 и 48 мСм/см. Объем элюирующего буфера 3,5 л, скорость элюции 4,7 л/час. Объем продукта 0,4 л, количество 45000 ME. Выход на стадии целевого продукта составляет 65%, активность Ф VIII в целевой фракции равна 110 МЕ/мл, а удельная специфическая активность Ф VIII повысилась от 45 до 150 МЕ/мг белка. Данные представлены на рисунке 3 (Хроматографическая очистка Ф VIII).

6. Стерильную фильтрацию целевой фракции хроматографической очистки после разведения до требуемой активности и стабилизации альбумином (конечная концентрация 0,1%) проводят с помощью фильтров Millipore с диаметром пор 0,22 мкм и стерильный продукт разливают во флаконы. На выходе стадии после проведения соответствующих анализов объем целевого продукта составляет 2,2 л, суммарная активность Ф VIII — 44000 ME (98%).

7. Целевой продукт замораживают при -50°С и давлении, равном 1 бар, в течение 75 часов и затем лиофилизируют в условиях -20°С-+30°С при давлении 60 мкбар в течение 40,5 часа. Затем проводят термическую вирусную инактивацию при 80°С и давлении 60 мкбар в течение 72 часов. Выход целевого препарата Ф VIII равен 40000 ME. Выход на стадии 90%. Выход всего технологического процесса — 30%.

Пример 2.

1. 220 л Свежезамороженной плазмы доноров, прошедшей аттестацию на наличие инфекций, с активностью Ф VIII, равной 0,9 МЕ/мл (содержание основного продукта 198000 ME), размораживают в реакторе при температуре -0,5°С и выделяют криопреципитат (КП) с помощью проточной центрифуги при 18000 об/мин и 3°С. Масса КП составляет 2,2 кг, содержание целевого продукта 109470 ME (выход по целевому продукту 55,3%).

2. Полученный КП растворяют в водном растворе гепарина (20 МЕ/мл, очищенная вода) и солюбилизируют при 25°С. pH Растворенного и солюбилизированного КП корректируют до 6,8.

3. Сорбцию факторов протромбинового комлекса осуществляют добавлением к КП 3% геля гидроксида алюминия в количестве, равном 1/10 от массы КП, с перемешиванием при 25°С в течение 15 минут. Осаждение фибриногена, фибринектина и балластных белков проводят добавлением 32% ПЭГ-4000 до конечной концентрации 3,5%. pH Доводят до 6,6 и смесь центрифугируют при 4000 об/мин при 2-4°С. Содержание целевого продукта 88450 ME (выход на стадии 81%).

4. Вирусную инактивацию сольвент-детергентным методом проводят добавлением 11% раствора Твин 80 до конечной концентрации 1% с последующим медленным добавлением три-n-бутилфосфата до конечной концентрации 0,3%; pH доводят до 6,8. Вирус-инактивированный полупродукт фильтруют через фильтры Millipore диаметром пор 2-8 мкм. Содержание на стадии целевого продукта 87 565 ME (99%).

5. Хроматографическое фракционирование проводят с помощью ионообменника EMD-TMAE Fractogel, стартового, промежуточного и элюирующего буферов с концентрациями ионов натрия 130, 170 и 450 ммоль/л и проводимостью 15, 18 и 48,0 мСм/см. Объем элюирующего буфера 3,5 л, скорость элюции 4,7 л/час. Содержание целевого продукта 68 400 ME. Выход на стадии целевого продукта составляет 78%, удельная специфическая активность Ф VIII равна 165 МЕ/мг белка.

Содержание фактора VIII — 65830 ME, выход целевого продукта на стадии составил 96%.

7. Целевой продукт замораживают при -50°С и давлении, равном 1 бар, в течение 75 часов и затем лиофилизируют в условиях -20°С-+30°С при давлении 60 мкбар в течение 40,5 часа. Затем проводят термическую вирусную инактивацию при 80°С и давлении 60 мкбар в течение 72 часов. Выход целевого препарата Ф VIII равен 59100 ME. Выход на стадии 90%. Выход всего технологического процесса — 30%.

Полученные антигемофильные концентраты Ф VIII были стерильными, характеризовались суммарным содержанием белка (эндогенный белок и экзогенный альбумин) 1,5-1,8 мг/мл, концентрацией ионов натрия 165-175 ммоль/л; целевой Ф VIII (после хроматографической очистки) обладал высокой специфической удельной активностью (не менее 140 МЕ/мг белка). Фармакокинетика полученного препарата Ф VIII в плазме практически не отличалась от таковой антигемофильного препарата Immunate (Baxter, США); данные представлены на рисунке 4 (Фармакокинетика полученного препарата Ф VIII и препарата Immunate).

Полученный препарат Ф VIII, согласно разрешению на медицинское применение, использовали в клинике Гематологического научного центра РАМН для лечения 20 больных гемофилией А. Показаны высокая лечебная эффективность и хорошая степень восстановления полученного препарата Ф VIII.

Способ выделения фактора VIII из плазмы крови человека, не инфицированной по данным соответствующего анализа вирусами гепатита и ВИЧ 1/2, заключающийся в последовательных криоосаждении, растворении в водном растворе гепарина и солюбилизации криопреципитата, сорбции факторов протромбинового комплекса гидроксидом алюминия, удалении фибриногена, фибронектина и примесных белков полиэтиленгликолем-4000, вирусной инактивации с помощью сольвент-детергентов и предварительной фильтрации, анионообменной хроматографии, предпочтительно с применением EDM-ТМАЕ Fractogel, с элюцией натрий хлоридсодержащим буфером, стабилизации раствором альбумина, стерильной фильтрации на мембранных фильтрах с диаметром пор 0,22 мкм, розливе во флаконы (200-300 МЕ/флакон), лиофилизации и повторной термической вирусной инактивации, отличающийся тем, что при очистке используют водный раствор нефракционированного гепарина с концентрациями, равными 5-100 Международных (МЕ)/мл, предпочтительно 10-25 МЕ/мл, полиэтиленгликоля-4000 в конечной концентрации 3,5% и подкисление среды предпочтительно до величины pH 6,6, сильные анионообменники группы ТМАЕ, то есть новую комбинацию условий, существенно повышающую эффективность очистки и удельную специфическую активность фактора VIII.

Источник: findpatent.ru