Агрегационная функция тромбоцитов


Для оценки функции тромбоцитов в Лаборатории ЦИР проводится анализ на индуцированную агрегацию тромбоцитов. Это анализ высокого качества, выполняется на автоматическом агрегометре. Так как этот анализ резко меняется при приеме препаратов, влияющих на свертывание крови (антиагреганты, например, аспирин, тромбо-асс, антикоагулянты, например, гепарин), желательно сдавать его до начала приема этих лекарств. По каждой агрегатограмме врач-лаборант выдает заключение.

image002.gifАнализ на агрегацию тромбоцитов рекомендуется в следующих случаях: при image003.jpgневынашивании беременности, неудачных попытках ЭКО, тяжелых осложнениях беременности в анамнезе, бесплодии неясного генеза, а также при повышенной кровоточивости: легкое образование синяков, меноррагии, носовые кровотечения.


В кривой агрегации оцениваются амплитуда агрегации, форма кривой, наличие одной или двух волн, а также наличие дезагрегации.

На приведенном образце обозначены: 1- обнуление прибора, 2 — до добавления индуктора, 3 — пик, связанный с разведением пробы индуктором, 4 — начало отсчета, первая волна, 5 — вторая волна, 6 — дезагрегация.

Важная информация: сочетание приема пищевых продуктов, фитопрепаратов и пищевых добавок, содержащих компоненты из данного списка, с приемом антиагрегантов (тромбоАСС) и антикоагулянтов (гепарин) является опасной по риску кровотечения комбинацией (категория D по классификации FDA). Риск кровотечения в большинстве случаев превышает потенциальную пользу.

Подробнее В ЗАО «Лаборатории ЦИР» выполняется агрегация тромбоцитов со следующими индукторами:

  • Агрегация с АДФ
  • Агрегация с арахидоновой кислотой
  • Агрегация с адреналином (эпинефрином)
  • Агрегация с ристоцетином.
    Три первых индуктора позволяют оценить функцию тромбоцитов разных сторон, они дополняют друг друга. Агрегация с ристоцетином позволяет заподозрить опасное по кровотечениям состояние – болезнь Виллебранда (дефицит фактора фон Виллебранда). При планировании беременности этот анализ важен для исключения риска кровотечения в родах.

image007.gifАгрегация с АДФ (синяя линия) и арахидоновой кислотой. Агрегационный ответ резко снижен. Дезагрегация практически отсутствует.







image008.gif

Агрегация с АДФ.
Агрегационный ответ снижен. Дезагрегация практически отсутствует.









image009.gifАгрегация тромбоцитов при приеме НПВС (максимальное влияние оказывает аспирин)

Агрегация с арахидоновой кислотой.
Агрегационный ответ отсутствует. Частая ситуация при приеме нестероидных противовоспалительных препаратов


image010.gif image011.gif

Также при этом может снижаться агрегация тромбоцитов с АДФ и адреналином.

image012.gif Агрегация с АДФ, ответ снижен. Частичная дезагрегация.

image014.gifАгрегация с ристоцетином, агрегационный ответ резко снижен.









Анализ сдается в Марьино в будние дни и в субботу с 9.00 до 11.00, на Третьяковской и Войковской в будние дни с 8.00 до 10.00.


Источник: www.cirlab.ru

Исследование агрегационной способности тромбоцитов

Обследование пациентов с кровотечением требует тщательного анамнеза, в том числе семейного, сведений о приеме лекарственных препаратов, физикального обследования, и только после этого лабораторного исследования.

Количественные и функциональные нарушения тромбоцитов часто встречаются у пациентов с кровотечениями.

Типы нарушений функции тромбоцитов:


Нарушение функции тромбоцитов Вероятный диагноз
Нарушение адгезивной функции тромбоцитов

Синдром Бернара-Сулье

Велокардиофасциальный синдром

Тромбастения Гланцманна

Врожденная афибриногенемия

Болезнь фон Виллебранда (возможно — тромбоцитарный тип болезни фон Виллебранда)

Дефекты рецепторов коллагена

Аномалии тромбоцитарных рецепторов

Дефекты рецепторов TxA2

Дефект α-адренергических рецепторов

Дефект P2Y12 рецепторов
Антитромбоцитарные препараты (например, клопидогрель)

Аномалии тромбоцитарных гранул

Дефицит плотных гранул

— дефицит α-гранул

— синдром серых тромбоцитов

Аномалии секреции содержимого гранул тромбоцитов, либо нарушение передачи сигнала в тромбоцитах Первичные дефекты секреции
Дефекты агрегации, которые аналогичны тем, которые наблюдаются при расстройствах пула хранения тромбоцитов, но с нормальным содержанием гранул и ТхА2
Дефекты агонистов рецепторов на поверхности тромбоцитов
— адреналина
— тромбоксана
— АДФ
— коллагена
Дефекты в активации белка G (дефекты внутриклеточной передачи сигнала)
Нарушение метаболизма арахидоновой кислоты

Дефекты циклооксигеназы

Дефицит тромбоксансинтазы

Прием наркотических препаратов

Нарушение прокоагулянтного механизма тромбоцитов Синдром Скотта
Дефекты цитоскелета тромбоцитов

Расстройства, связанные с MYH9

Синдром Вискотта-Олдрича

До проведения специфических анализов, исследующих функциональные свойства тромбоцитов, рекомендуется выполнить следующие лабораторные тесты:


  1. Общий анализ крови с определения количества тромбоцитов и среднего объема тромбоцитов. Это имеет значение при наследственной макротромбоцитопении (синдроме Бернара-Сулье), микротромбоцитопении (синдроме Вискотта-Олдрича), при некоторых заболеваниях костного мозга.
  2. Изучение мазка крови и морфологии тромбоцитов. Необходимо для установления таких диагнозов, как псевдотромбоцитопения, синдром серых тромбоцитов.  В некоторых случаях, например, при тромбоцитопении Хегглина мазок крови может показать наличие телец Деле (светло-серо-голубых овальных базофильных лейкоцитарных включений, расположенных в периферической цитоплазме нейтрофилов).

Специфические лабораторные тесты для определения функциональных свойств тромбоцитов включают в себя такие обследования как:

— скрининговые тесты, отражающие функциональную активность тромбоцитов, например, активированное время свертывания (АСТ), время кровотечения (ВК) и PFA-100,
— агрегометрия например, классическая агрегометрия по Борну,
— проточная цитометрия для количественной оценки наличия или отсутствия мембранных гликопротеинов тромбоцитов,
— специализированные исследования, применяемые в научно-исследовательских лабораториях.

Принцип метода агрегатометрии по Борну:

Метод измерения агрегации тромбоцитов турбидиметрическим методом по Born (по Борну) основан на регистрации изменений светопропускания в суспензии тромбоцитов. Эти изменения обусловлены снижением светорассеивания и увеличением светопропускания (прозрачности) суспензии в процессе образования тромбоцитарных агрегатов.


В классической агрегометрии по Борну используется плазма, богатая тромбоцитами (БТП). В агрегометре БТП перемешивается в кювете при температуре 37°С. При добавлении агониста образующиеся агрегаты тромбоцитов поглощают меньше света, что регистрируется фотоэлементом.

Агрегационная функция тромбоцитов

ОТП – обедненная тромбоцитами плазма, БТП – богатая тромбоцитами плазма.

Наглядно принципы агрегометрии по Борну можно увидеть на анимационной англоязычной презентации, любезно предоставленной авторами научного сайта http://www.platelet-research.org — http://www.platelet-research.org/3/aggregometry.htm.

Преаналитическая вариабельность

Препараты, блокирующие функции тромбоцитов, включают в себя НПВП (нестероидные противовоспалительные препараты), специфические антитромбоцитарные препараты, такие как клопидогрель, а также некоторые антибиотики, антидепрессанты, бета-блокаторы и пр. На функцию тромбоцитов могут влиять также такие продукты, как чеснок, куркума и кофеин, продукты с высоким содержанием жиров (они могут привести к появлению хиломикронов в плазме, что препятствует нормальному светопропусканию в процессе проведения тестирования агрегации тромбоцитов).
Ряд факторов может влиять на правильность результатов агрегации тромбоцитов:


— очень высокое или низкое количество тромбоцитов;

— температура — образцы крови для тестирования агрегации тромбоцитов следует хранить при комнатной температуре;

— рН — агрегацию тромбоцитов следует проводить при физиологическом значении рН;

— концентрация фибриногена.

Агонисты тромбоцитов:

Добавление агониста тромбоцитов к ОТП приводит к активации тромбоцитов, изменению их формы от дискоидной до сферической, которая связана с увеличением оптической плотности в процессе активации тромбоцитов. Единственным исключением из этого являются адреналин  (эпинефрин), который не приводит к изменению формы тромбоцитов, и ристоцетин, который вызывает не агрегацию, а агглютинацию тромбоцитов.

Существуют два типа агонистов:

сильные агонисты — коллаген, тромбин, ТхА2, арахидоновая кислота — непосредственно вызывают агрегацию тромбоцитов, синтез и секрецию ТхА2 гранул тромбоцитов.

слабые агонисты — АДФ и адреналин — вызывают агрегацию тромбоцитов, не вызывая секреции.

Сильные агонисты при низких концентрациях могут действовать как слабые агонисты, но слабые агонисты, даже при высоких концентрациях, не будут действовать в качестве сильных агонистов.


С некоторыми слабыми агонистами (АДФ и адреналин) кривая агрегации тромбоцитов может иметь двухфазный вид — начальную волну агрегации (первичную волну), а затем вторичную волну агрегации, которая, как правило, необратима. При более высоких концентрациях АДФ две волны агрегации сливаются и двухфазный сигнал отсутствует.

Реакция агрегации к агонисту усиливается при высвобождении ТхА2 из фосфолипидов мембран и секреции АДФ из плотных гранул. АДФ и ТхА2 являются агонистами, которые, взаимодействуя с их специфическими рецепторами, усиливают реакцию агрегации тромбоцитов.

Рабочие концентрации используемых агонистов и механизм их действия:

Агонист Рабочая концентрация (С) Механизм действия
АДФ

Низкая –1.0 μM,

2.5 μM,

5.0 μM
Высокая –

10.0 μM

АДФ связывается со своим рецептором на поверхности тромбоцитов. Первоначальное связывание приводит к высвобождению внутриклеточного кальция и изменению формы тромбоцита, ведущее к образованию первичной волны агрегации. Вторичная волна отражает высвобождение АДФ из гранул хранения тромбоцитов. Низкая доза АДФ вызывает лишь первичную агрегацию и ее эффект является обратимым.


АДФ связывается с двумя G-белками рецепторов P2Y1 и P2Y12. Связывание АДФ с рецептором P2Y1 вызывает изменение формы и инициирует агрегацию тромбоцитов (первичную волну) за счет мобилизации кальция. Рецептор P2Y12 считается основным АДФ-рецептором и ответственным за полную агрегацию тромбоцитов через ингибирование аденилциклазы.

Рецептор P2Y12 является также мишенью для клопидогреля. Вторая волна АДФ-индуцированной агрегации подавляется аспирином и НПВС.

Адреналин 5 μM, 10μM Адреналин связывается с α2-адренергическим рецептором на поверхности тромбоцитов, что приводит к ингибированию аденилциклазы и высвобождению ионов кальция. Агрегация тромбоцитов с адреналином визуально аналогична агрегации с АДФ с наличием начальной первичной волной агрегации, высвобождением сохраненного АДФ из тромбоцитов и второй волной необратимой агрегации. Как и с АДФ, эта вторая волна агрегации подавляется аспирином и НПВС. Адреналин,  как и АДФ считается слабым агонистом.
Ристоцетин Низкая –0.5 mg/mL
Высокая –1.5 mg/mL,5 mg/mL
Ристоцетин в высоких концентрациях вызывает агглютинацию тромбоцитов через фактор Виллебранда и комплекс GPIb-IX-V.
Коллаген 1, 4μg/mL

Коллаген связывается с рецепторами GРVI и GРIa / IIa, индуцируя высвобождение содержимого гранул, пул TXA2, а затем приводит к устойчивой активации GPIIb-IIIa.Рецептор GРIa / IIa участвует в адгезии тромбоцитов. Рецептор GРVI участвует в передаче сигналов тромбоцитов и генерации TхA2.

Лаг-фаза формируется после добавления коллагена к ОТП обычно меньше, чем за 1 мин. 

Арахидоно-вая кислота 500μg/mL Арахидоновая кислота является предшественником TхA2 в тромбоцитах. Арахидоновая кислота превращается в TхA2 при участии циклооксигеназы и тромбоксан-синтетазы. ТхА2 является мощным индуктором агрегации тромбоцитов, вызывая высвобождение гранул, образование еще большей генерации TхA2 и затем устойчивой активации рецепторов GРIIb-IIIа.
Тромбин

Низкая –50 nmol/L

Высокая –

100 nmol/L

Тромбин является самым мощным физиологическим активатором тромбоцитов, действующим на рецепторы PAR1 и PAR4.Тромбин вызывает агрегацию тромбоцитов даже при низких концентрациях, это не приводит к полной агрегации, однако при меняет форму тромбоцитов. При более высокой концентрации тромбин индуцирует полную агрегацию тромбоцитов.

 

Используемая аббревиатура: БТП – бедная (обедненная) тромбоцитами плазма, ОТП – обогащенная тромбоцитами плазма, TхA2 — тромбоксан А2, С – концентрация, GP – гликопротеид.

Вид классической двухфазной кривой агрегации тромбоцитов:

Агрегационная функция тромбоцитов

При введении адреналина и низких доз АДФ обычно образуется двухфазная кривая агрегации, в то время как при введении других агонистов, либо при высоких концентрациях индукторов, возможно слияние первой и второй волн. При двухфазной агрегации вторая волна связана с реакцией высвобождения гранул тромбоцитов.

Параметры агрегатограммы.

Агрегационная функция тромбоцитов

Основные параметры агрегатограммы можно интерпретировать только после предварительной оценки активности тромбоцитов по типам кривых агрегатограммы (обратимая, двухфазная, необратимая и отсутствие агрегации тромбоцитов).

Основными параметрами агрегатограммы являются интенсивность первичной (Тпа), вторичной (Тва), максимальной агрегации (Тма) и дезагрегации (Тда). О динамике процесса агрегации на графике следует судить по углам наклона кривой агрегатограммы на этапе первичной агрегации (α1), вторичной агрегации (α2) и дезагрегации ). Характеристикой динамики реакции высвобождения эндогенных стимуляторов агрегации тромбоцитов является время латентного периода для коллаген-индуцированной агрегации (tлп) и время начала вторичной агрегации (tва) в норме для двухфазных кривых агрегатограммы (высоких доз АДФ  и адреналина).

Для агрегации, индуцированной коллагеном важно также оценить укорочение или удлинение латентного периода (tлп) по сравнению с величиной этого показателя у здоровых людей.

Качественная оценка агрегатограммы позволяет не только диагностировать гипер- или гипореактивность тромбоцитов, но и предположить причины их возникновения. Для количественной регистрации различных типов агрегатограмм следует вычислять следующие показатели:

— при необратимой агрегации – Тма, Тпа, Тда, Tва, α1, α2, из которых самыми информативными являются Тва, α2 и Tва;

— при обратимой агрегации – Тма и Тда.

Диапазон колебаний основных показателей агрегатограммы:

Параметры агрегатограммы Диапазон изменений Параметры агрегатограммы Диапазон изменений
Тма 30-50% Tва 30-45 с
Тва 30-40% α1 60-75 º
Тда 60-80% (от величины Тпа) α2 60-75 º
Тпа 10-20% β 30-45 º
tлп 25-30 с  

Референсные значения

Агрегационная активность в норме составляет при использовании индукторов:

  • Агрегация тромбоцитов с АДФ (5,0 мкмоль/мл): 60-90%
  • Агрегация тромбоцитов с АДФ (0,5 мкмоль/мл): 1,4-4,3%
  • Агрегация тромбоцитов с адреналином: 40-70%
  • Агрегация тромбоцитов с коллагеном: 50-80%

Интерпретация данных

Ориентировочный диагноз Изменения на агрегатограмме
Тромбастения Гланцманна или афибриногенемия Отсутствие или значительное снижение агрегации при стимуляции любыми агонистами, кроме ристоцетина
Синдром Бернара-Сулье или болезнь фон Виллебранда Отсутствие или значительное снижение агрегации с ристоцетином
Нарушение пула хранения Первичная волна агрегации только с АДФ, адреналином и коллагеном.
Действие аспирина или аспириноподобный эффект Отсутствие агрегации с арахидоновой кислотой. Присутствие первичной волны только с АДФ. Снижение или отсутствие агрегации с коллагеном.
Действие клопидогреля Отсутствие агрегации с АДФ
2В тип болезни фон Виллебранда (БВ) или тромбоцитарный тип БВ Агрегация с низкой дозой ристоцетина (0,5 мг/мл)

 

Ссылка на методическое пособие «Клинико-лабораторная диагностика нарушений функции тромбоцитов». Васильев С.А., Берковский А.Л., Мелкумян А.Л., Суворов А.В., Мазуров А.В., Козлов А.А. ФГБУ Гематологический научный центр, МЗ РФ, Москва, 2013 г.

 

При подготовке раздела использованы данные научного сайта www.practicalhemostasis.com.

Источник: www.renam.ru

Агрегация тромбоцитов с АДФ

Воздействие малых доз АДФ (обычно 1*10-7 моль) приводит к формированию двойной волны агрегации. Первая фаза (первичная волна) зависит от добавленного экзогенного АДФ, а вторая фаза (вторичная волна агрегации) возникает за счет реакции высвобождения собственных агонистов, содержащихся в гранулах тромбоцитов. Большие дозы АДФ (обычно 1*10-5 моль) приводят к слиянию первой и второй волн агрегации.

При анализе агрегатограмм обращают внимание на общий характер агрегации (одноволновая, двухволновая; полная, неполная; обратимая, необратимая) и скорость агрегации. Появление двухволновой агрегации при стимуляции АДФ в концентрациях, вызывающих в норме обратимую агрегацию (обычно 1-5 мкмоль), указывает на повышение чувствительности тромбоцитов, а развитие одноволновой неполной (а часто и обратимой) агрегации при стимуляции АДФ в концентрациях 10 мкмоль и больше – на нарушение реакции высвобождения тромбоцитов.

Агрегация тромбоцитов с ристоцетином

Определение агрегации тромбоцитов с ристоцетином в плазме применяют для количественной оценки фактора Виллебранда. В основе метода лежит способность ристоцетина стимулировать in vitro взаимодействие фактора Виллебранда с тромбоцитарным гликопротеидом Ib. В большинстве случаев болезни Виллебранда отмечается нарушение ристоцетин-агрегации при нормальном ответе на воздействие АДФ, коллагена и адреналина. Нарушение ристоцетин-агрегации выявляют и при болезни Бернара-Сулье. Для дифференциации применяют тест с добавлением нормальной плазмы: при болезни Виллебранда после добавления нормальной плазмы ристоцетин-агрегация нормализуется, в то время как при синдроме Бернара-Сулье этого не происходит. Индуцированная ристоцетином агглютинация тромбоцитов снижена при большинстве случаев болезни Виллебранда, кроме типа IIВ.

Агрегация тромбоцитов с коллагеном

Агрегация тромбоцитов с коллагеном имеет достаточно выраженную латентную фазу, во время которой происходит активация фосфолипазы С. В зависимости от концентрации используемого реагента продолжительность этой фазы может составлять 5-7 минут. После завершения этого периода в тромбоцитах происходят процессы, приводящие к образованию вторичных посредников, вследствие чего развивается секреция тромбоцитарных гранул и синтез тромбоксана А2, что сопровождается резким усилением межтромбоцитарного взаимодействия.

В лабораторно-клинической практике коллаген чаще всего используют в конечной концентрации 50 мкг/мл, однако коллагены разных фирм могут обладать различной активностью, что необходимо учитывать при их применении.

Агрегация тромбоцитов с адреналином

Адреналин при контакте с тромбоцитами взаимодействует с α2-адренорецепторами, что вызывает ингибирование аденилатциклазы. Не исключено, что механизм, лежащий в основе реализации эффекта адреналина и развития первой волны агрегации, не зависит от образования тромбоксана А2, реакции высвобождения или синтеза фактора агрегации тромбоцитов, а связан со способностью адреналина прямо изменять проницаемость клеточной мембраны для ионов кальция. Вторая волна агрегация возникает как результат реакции высвобождения и продукции тромбоксана А2.

Агрегация тромбоцитов с арахидоновой кислотой

Арахидоновая кислота – природный агонист агрегации, причем ее действие опосредовано эффектами простагландинов G2 и H2, тромбоксана А2, и включает активацию как фосфолипазы C с последующим образованием вторичных посредников, мобилизацией внутриклеточного кальция и расширением процесса активации клеток, так и фосфолипазы А2, что непосредственно приводит к освобождению эндогенной арахидоновой кислоты. Агрегация тромбоцитов с арахидоновой кислотой происходит достаточно быстро, поэтому кривая, характеризующая этот процесс, чаще носит одноволновый характер.

Для индукции агрегации кровяных пластинок арахидоновую кислоту используют в концентрациях 10-3-10-4моль. При работе с арахидоновой кислотой следует учитывать, что на воздухе это вещество очень быстро окисляется.

Пробу на агрегацию с арахидоновой кислотой рекомендуют проводить в случаях использования лекарственных средств, влияющих на реакцию агрегации (например, ацетилсалициловая кислота, пенициллин, индометацин, делагил, диуретики), что нужно учитывать при оценке результатов исследований.

Источник: www.cmd-online.ru

Нормы агрегации тромбоцитов у беременных

В период беременности здоровый показатель скорости склеивания тромбоцитов у женщин колеблется от 30 до 60%, причем без привязки к определенному индуктору. Беременной женщине не стоит самой оценивать анализ, предоставьте это наблюдающему вас врачу.

Что показывает анализ на агрегацию тромбоцитов

Если содержание повышено, речь идет о гиперагрегации (сгущение крови вплоть до образования сгустков-тромбов). Низкая концентрация – это гипоагрегация (хрупкие сосуды, частые кровотечения). И в том, и в другом случае результаты должен увидеть врач, чтобы назначить оптимальную терапию.

В расшифровке исследования также указывают следующие пункты:

Показатель Норма
Время течения крови Примерно 3 мин
Свертываемость До 20%
Время агрегации Около 10 минут (кровь из вены)td>
Протромбиновый индекс 92-106%
Тромбиновое время 14-19 секунд
Фибриноген 2-4 г/л
Активированное частичное тромбопластиновое время 30-40 секунд
Адгезия 21-50%

В ходе лечения специалисты рекомендуют сдавать кровь на агрегацию тромбоцитов несколько раз, с промежутком в две-три недели. Свежие данные дадут возможность увидеть динамику, оценить эффективность лечения.

Источник: www.medzhencentre.ru


Leave a Comment

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте, как обрабатываются ваши данные комментариев.