Окраска ретикулоцитов

Перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на каплю 1% раствора оксалата калия 4 капли раствора краски бриллиантового крезилового синего. В краску добавляют 0,04 мл крови (две пипетки до метки0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 минут. Затем снова перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 2 — окраска ретикулоцитов в пробирке азуром II.

В пробирку помещают 0,05 мл раствора краски азур II и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 20 – 30 минут.

Снова перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 3 — окраска ретикулоцитов в пробирке азуром I.

В пробирку помещают 0,3 – 0,5 мл раствора краски азур I и 5 – 6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку закрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1 – 1,5 часа (ретикулоциты окрашиваются лучше при экспозиции 1,5 – 3 часа). Перемешивают и готовят тонкие мазки.

В настоящее время в продаже имеются готовые красители для ретикулоцитов заводского изготовления. Окраска ретикулоцитов с их помощью производится согласно прилагаемой инструкции.

Подсчет ретикулоцитов

Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. В мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I).

Интерпретация результатов

Для исследования были отобраны 20 образцов крови для определения уровня глюкозы и гликозилированного гемоглобина с «Сахарным диабетом» в анамнезе у пациентов отделения «Эндокринология" ГБУЗ «навлинскаяя ЦРБ»для дальнейшего исследования значения гемоглобина, ретикулоцитов, эритроцитов. Исследования проводились на базе клинической лаборатории.

Для точной интерпретации результатов необходимо вспомнить нормальные показатели: глюкозы- 3,3-5,5ммоль/л и гликозилированного гемоглобина от 4% до 5,9% .

Материал для исследования уровня глюкозы и гликозилированного гемоглобина: негемолизированная кровь.

Для исследования данных показателей кровь берут натощак. Желательно сдавать кровь до 10 — 10.30.часов утра. За день до сдачи анализа по возможности исключить тренировки и стрессы, за полчаса до забора крови желательно находится в спокойном состоянии.

На основании результатов исследования20 образцовкрови была выявлена группа образцов с повышенным содержанием глюкозыгликозилированного гемоглобина. Результаты исследования представлены в таблице 2.1.

Таблица 2. 1. — Показатели уровня глюкозы и гликозилированного гемоглобина у группы исследуемых пациентов.

№ образца крови	Уровень глюкозы в крови, ммоль/л	Уровень гликозилированного гемоглобина, %
1	3,6	5,4
2	6,2	6,8
3	6,0	7,9
4	5,2	3,7
5	3,4	5,1
6	4,8	6,7
7	4,7	4,6
8	3,8	5,3
9	5,6	6,8
10	6,5	6,6
11	5,3	5,5
12	3,2	7,1
13	5,8	6,7
14	5,3,	6,0
15	5,8	6,9
16	4,4	5,6
17	3,2	4,6
18	6,6	7,8
19	4,9	4,4
20	3,3	4,5

Анализируя полученные результаты таблицы 2.1 в ходе исследования образцов крови с нормальным уровнем глюкозы для определения значений гликозилированного гемоглобина можно заметить следующее:

1) У 1,2,3,5,6,7,8,11,14,16,17,18,20 образцов крови уровень глюкозы и уровень гликозилированного гемоглобина, находятся в диапазоненормальных величин.

2) У образцов 2 , 3 ,9, 10,12,13,15,18нормальный показатель глюкозы, но уровень гликозилированного гемоглобина находится выше нормы. Можно предположить, что на следствие изменения гликозилированного гемоглобина повлияла, длительная гипергликемия.

В определении уровня гемоглобина, уровня эритроцитов и процентный уровень ретикулоцитов в крови с повышенным содержанием глюкозы были исследованы 8 образцов крови.

Таблица 2.2. Определение уровня эритроцитов, гемоглобина и ретикулоцитов в образцах с повышенным содержанием глюкозы.

Номер образца крови	Пол	Уровень глюкозы в крови, ммоль/л	Уровень гемоглобина г/л	Уровень эритроцитов /л	Уровень ретикулоцитов %
2	ж	6,2	158	5,1	1,3
3	м	6,0	171	4,7	1,4
9	м	5,6	113	5,8	1,6
10	ж	6,5	117	0,1	20,8
12	ж	3,2	161	4,2	20,6
13	м	5,8	156	4,5	4,6
15	ж	5,8	154	6,1	1,4
18	м	6,6	135	6,5	1,3

Анализируя полученные результаты были выделены 3 группы:

1) у 2,13,18 исследуемых анализов крови уровень гемоглобина в норме, уровень эритроцитов в норме, уровень ретикулоцитов в норме.

2) у 3 и 12 уровень гемоглобина повышен, уровень эритроцитов повышен, уровень ретикулоцитов повышен, можно предположить что повышение глюкозы не носит постоянный характер и системы гемопоэза компенсирует недостаток гемоглобина и эритроцитов возникший вследствие повышения гликозированного гемоглобина.

3) у 9,10,15 уровень гемоглобина повышен, уровень эритроцитов понижен, уровень ретикулоцитов повышен. Можно предположить, что уровень глюкозы повышается довольно часто и некомпенсированн медикаментозно в следствие этого возникают признаки анемии, а именно снижение гемоглобина и повышение эритроцитов и ретикулоцитов.

Наглядно выводы, сформулированные при анализе результатов исследования проб крови у пациентов с повышенным уровнем глюкозы можно рассмотреть на диаграмме 2.1.

Диаграмма 2.1.- Зависимость уровня глюкозы и количества ретикулоцитов

Рассмотрев данную диаграмму 2.1 можно заметить, что уровень глюкозы повышается в следствии углеводного обмена. Показателем длительности некомпенсированного сахарного диабета является высокий уровень гликозилированного гемоглобина. При не частых повышениях данных показателей крови система гемопоэза восполняет необходимое для протекания физиологических процессов количество эритроцитов, наполненных гемоглобином — белком переносчиком кислорода к тканям и органам. Исходя из выше сказанного при стойком повышении в крови глюкозы и гликозилорованного гемоглобина происходит повышение ретикулоцитов как предшественников эритроцитов.

Источник: studopedia.net

Ретикулоциты – молодые эритроциты, образующиеся в костном мозге и в небольшом количестве находящиеся в крови. Они являются переходной формой между предшественниками эритроцитов в костном мозге и взрослыми эритроцитами, в большом количестве находящимися в кровяном русле.

Синонимы русские

Количество ретикулоцитов, подсчет количества ретикулоцитов, ретикулоцитарный индекс.

Синонимы английские

Retic count, reticulocyte index, corrected reticulocyte, reticulocyte count.

Метод исследования

Проточная цитофлуориметрия.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную, капиллярную кровь.

Единицы измерения

*10^9/л (10 в ст. 9/л), % (проценты).

Как правильно подготовиться к исследованию?

Исключить из рациона алкоголь в течение 24 часов до исследования.
Не принимать пищу за 2-3 часа до исследования (можно пить чистую негазированную воду).
Исключить физическое и эмоциональное перенапряжение за 30 минут до исследования.
Не курить за 30 минут до взятия крови.

Общая информация об исследовании

Ретикулоциты – молодые красные кровяные клетки (эритроциты). Они образуются в костном мозге, когда стволовые клетки дифференцируются и делятся, превращаясь во взрослые эритроциты через стадию ретикулоцитов, постепенно теряя ядро и уменьшаясь в размере.

У новорождённых ретикулоцитов больше, чем у взрослых.

Большинство эритроцитов уже полностью созревшие, когда они покидают костный мозг и выходят в кровяное русло, однако 0,5-2 % из всех циркулирующих в крови – это ретикулоциты, которые превращаются во взрослые эритроциты в течение двух дней. Данный анализ показывает число и процент ретикулоцитов в крови и выявляет адекватность производства эритроцитов костным мозгом и степень его активности.

Организм старается поддерживать примерно одинаковое число циркулирующих эритроцитов, в норме продолжительность жизни каждого из них – около 120 дней. При этом старые эритроциты уничтожаются в селезенке, а новые образуются в костном мозге. Этот процесс регулируется эритропоэтином – гормоном, который производится в почках. В ответ на снижение уровня кислорода в крови почкой вырабатывается эритропоэтин, который затем кровью доставляется в костный мозг, где стимулирует образование эритроцитов. Как только количество эритроцитов повышается, выработка эритропоэтина в почках снижается.

Если происходит разрушение эритроцитов (гемолиз) или нарушается их синтез в костном мозге, возникает анемия. Также ее развитию способствует потеря эритроцитов из-за кровотечения – тогда организм усиливает образование эритроцитов в костном мозге и количество ретикулоцитов в крови возрастает.

Поражение костного мозга (например, опухолью, химиопрепаратами или ионизирующим излучением) приводит к снижению производства эритроцитов и количества ретикулоцитов в костном мозге и периферической крови.

Недостаточное образование эритроцитов приводит к уменьшению их циркуляции в кровяном русле, количества гемоглобина и способности переносить кислород. Соответственно, образуется меньше ретикулоцитов.

В свою очередь, число ретикулоцитов и эритроцитов увеличивается при более активной работе костного мозга. К этому могут приводить разные причины, например увеличение продукции эритропоэтина, хронические расстройства, повышающие число эритроцитов (истинная полицитемия), или курение.

Для чего используется исследование?

Для дифференциальной диагностики типов анемий, а также для определения активности процессов образования эритроцитов в костном мозге.
Для определения тяжести анемии вместе с данным исследованием должен выполняться общий анализ крови, в рамках которого оценивается количество эритроцитов и эритроцитарные индексы, гематокрит и концентрация гемоглобина.

Когда назначается исследование?

При снижении общего количества эритроцитов, гемоглобина и при других признаках анемии или угнетения функции костного мозга. Основными симптомами этого являются: бледность кожи, повышенная утомляемость, одышка, кровь в стуле (признак хронической кровопотери).

Также анализ назначается для мониторинга лечения пациентов с железодефицитом, дефицитом витамина В₁₂или фолиевой кислоты, почечной недостаточностью, онкологическими заболеваниями.
Если количество эритроцитов повышено (для оценки функции костного мозга).

Что означают результаты?

Референсные значения

Ретикулоциты, % (RET %)

Пол	Возраст	Референсные значения
Женский	Меньше 2 недель	0,15 — 1,5 %
	2 недели – 1 месяц	0,45 — 1,4 %
	1-2 месяца	0,45 — 2,1 %
	2-6 месяцев	0,25 — 0,9 %
	6 месяцев – 2 года	0,2 — 1 %
	2-6 лет	0,2 — 0,7 %
	6-12 лет	0,2 — 1,3 %
	12-18 лет	0,12 — 2,05 %
	Больше 18 лет	0,59 — 2,07 %
Мужской	Меньше 2 недель	0,15 — 1,5 %
	2 недели – 1 месяц	0,45 — 1,4 %
	1-2 месяца	0,45 — 2,1 %
	2-6 месяцев	0,25 — 0,9 %
	6 месяцев – 2 года	0,2 — 1 %
	2-6 лет	0,2 — 0,7 %
	6-12 лет	0,2 — 1,3 %
	12-18 лет	0,24 — 1,7 %
	Больше 18 лет	0,67 — 1,92 %

Ретикулоциты (абсолютное количество, RET#)

Пол	Референсные значения
Женский	17 — 63,8 *10⁹/л
Мужской	23 — 70 *10⁹/л

Фракция незрелых ретикулоцитов (IRF)

Пол	Референсные значения
Женский	3 — 15,9 %
Мужской	2,3 — 13,4 %

Фракция ретикулоцитов низкой флюоресценции (LFR): 83 — 97 %.
Фракция ретикулоцитов средней флюоресценции (MFR): 2,9 — 15,9 %.
Фракция ретикулоцитов высокой флюоресценции (HFR): 0 — 1,7 %.

У здорового человека количество ретикулоцитов в целом стабильно. Когда количество эритроцитов или гематокрит уменьшаются, процент ретикулоцитов может быть повышенным относительно общего числа эритроцитов – это искусственное завышение числа ретикулоцитов. Так что для более точной оценки тяжести анемии в таких случаях лучше использовать ретикулоцитарный индекс – определение абсолютного количества ретикулоцитов. При этом гематокрит пациента сравнивается с нормальным уровнем гематокрита.

Ретикулоцитарный индекс рассчитывается по формуле: процент ретикулоцитов х гематокрит (показатель, характеризующий степень разжижения крови) / 45 х 1,85. При этом индекс менее 2 будет говорить о снижении активности производства эритроцитов, а больше 2-3 – напротив, о повышении.

Необходимо помнить, что уровень ретикулоцитов отражает недавнюю активность костного мозга.

Причины повышения уровня ретикулоцитов

Кровотечение. Если произошло кровотечение, уровень ретикулоцитов повысится через 3-4 дня, что будет характеризовать попытку костного мозга увеличить продукцию эритроцитов для того, чтобы возместить их потери. При хронической кровопотере уровень ретикулоцитов будет стойко повышен.
Гемолиз (показатель может повышаться до 300 % от нормы) – разрушение эритроцитов внутри организма. Он может происходить по разным причинам: из-за наследственного дефекта эритроцитов, в результате появления антител к собственным эритроцитам или токсического действия при малярии.
Результат лечения анемии. Повышение ретикулоцитов может использоваться как критерий эффективности лечения анемии, а также адекватности подбора дозировки препарата железа при железодефицитной анемии (повышение ретикулоцитов происходит на 8-12-й день). При лечении B₁₂-дефицитной анемии на 5-8-й день наступает так называемый ретикулоцитарный криз, что говорит об адекватности назначенного лечения.
Воспалительные процессы.
Онкологические заболевания костного мозга или метастазы других опухолей в костный мозг.
Полицитемия (повышение количества гемоглобина и эритроцитов) любого происхождения.
Восстановление работы костного мозга после химио- или лучевой терапии.
Прием эритропоэтина.
Если костный мозг не в состоянии обеспечивать адекватную продукцию эритроцитов в ответ на возрастающую потребность, то их количество может быть в норме или слегка пониженным, хотя в конечном итоге все равно будет снижаться.
Если у пациента анемия, а количество ретикулоцитов не повышается, это означает, что в той или иной мере присутствует нарушение работы костного мозга и/или дефицит эритропоэтина.

Причины понижения уровня ретикулоцитов

Железодефицитная анемия.
В₁₂-дефицитная анемия или фолиеводефицитная анемия.
Алкоголизм.
Микседема – снижение функции щитовидной железы.
Апластическая анемия (постоянно сниженный уровень ретикулоцитов – плохой прогноз).
Заболевания почек.
Опухолевое поражение костного мозга или метастазы других опухолей в костный мозг.
Химио- или лучевая терапия.
Хронические инфекции.
Уремия.
Прием карбамазепина или хлорамфеникола.

Что может влиять на результат?

У лиц, поднимающихся на большую высоту, концентрация ретикулоцитов увеличивается, так как их организм адаптируется к пониженной концентрации кислорода.
У курильщиков и у беременных уровень ретикулоцитов может быть повышен.
Жаропонижающие, леводопа повышают уровень ретикулоцитов, а азатиоприн, хлорамфеникол, метотрексат, сульфаниламидные препараты – напротив, понижают.

Важные замечания

Уровень ретикулоцитов позволяет более верно предположить, что именно происходит, однако сам по себе не дает основания поставить ни одного диагноза. Зато он может помочь с определением дальнейших обследований или использоваться для контроля терапии.
Ранее подсчет количества ретикулоцитов проводился вручную под микроскопом. Этот метод до сих пор иногда используется, однако автоматический подсчет обеспечивает гораздо более точные результаты.

Также рекомендуется

Общий анализ крови (без лейкоцитарной формулы и СОЭ)
Лейкоцитарная формула
Ферритин
Железо в сыворотке
Трансферрин
Эритропоэтин
Билирубин непрямой

Кто назначает исследование?

Терапевт, гематолог, педиатр, инфекционист, хирург, гинеколог.

Источник: helix.ru

Суправитальный метод окраски ретикулоцитов

Принцип:

Выявлениезернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитовпри окраске бриллиант-крезиловым синимбез предварительной фиксации.

Реактивы:

1% раствор бриллиант-крезилового синего:50 мг краски растворяют в 5 мл физиологическогораствора и добавляют 20 мг цитрата натрия(раствор хранят в посуде из темногостекла, годен в течение несколькихдней).

Методика:

Напредметное стекло с лункой наносят 2капли 1 % раствора краски бриллиантовогокрезилового синего и 1 каплю крови.Осторожно перемешивают стекляннойпалочкой и смесь помещают во влажнуюкамеру (чашку Петри, в которую по краямвкладывают слегка смоченные валикимарли или ваты) на 30 минут при комнатнойтемпературе. Затем делают мазки ивысушивают.

Подсчетретикулоцитов:

Вмазках эритроциты окрашиваются вжелтовато-зеленый цвет, а зернисто-сетчатаясубстанция в ретикулоцитах – в синий ифиолетовый цвет.

Мазкимикроскопируют с иммерсионным объективом.Подсчет ретикулоцитов производят на1000 эритроцитов (большая точностьполучается при подсчете 2000-3000 эритроцитов).

Увеличениечисла ретикулоцитов наблюдаетсяпри:

стимуляции эритропоэза (кровопотеря, гемолиз, ретикулоцитарный криз при успешном лечении В12-дефицитной анемии, острый недостаток кислорода).

Уменьшениечисла ретикулоцитов наблюдаетсяпри:

угнетении эритропоэза (апластические и гипопластические анемии, нелеченные В12-дефицитные анемии, метастазы рака в кости),
заболеваниях почек, эндокринных заболеваниях.

Увеличениеретикулоцитов их в периферической крови(ретикулоцитоз) отмечается:•при гемолитическиханемиях (числоретикулоцитов может доходить до 60% иболее (особенно сильно увеличиваясьпри гемолитических кризах);•при острых кровопотерях (на 3 – 5 суткипосле кровопотери возникает ретикулоцитарныйкриз), в том числе, увеличение ретикулоцитовпозволяет заподозрить скрытое кровотечение(например, у больных язвенной болезньюжелудочно-кишечного тракта, брюшнымтифом);•при малярии; •при полицитемии; •при лечении железом железодефицитныханемий (через несколько дней (3 – 10) посленачала антианемического леченияпернициозной анемии); •при остром недостатке кислорода;•при метастазах опухолей в костныймозг. Следуетпомнить,что в случае усиленного разрушенияэритроцитов доля ретикулоцитов можетпревышать 50% вследствие искусственногозавышения числа ретикулоцитов (как ужебыло отмечено ранее, доля ретикулоцитоврассчитывается в % от всех эритроцитов).В таких случаях ля оценки тяжести анемийиспользуют «ретикулярный индекс»,который рассчитывают по формуле: (%ретикулоцитов х гематокрит) / 45 х 1,85, где45 – нормальный гематокрит, 1,85- количествосуток, необходимых для поступленияновых ретикулоцитов в кровь. Если индекс< 2 – говорит о гипопролиферативномкомпоненте анемии, если > 2-3, то происходитувеличение образования эритроцитов. Истинныйретикулоцитоз:увеличение количества ретикулоцитовв периферической крови с одновременнымувеличением количества ретикулоцитовв костном мозге. Ложныйретикулоцитоз:отсутствие повышенного количестваретикулоцитов в костном мозге приповышении их количества в периферическойкрови (что говорит об усилении вымыванияретикулоцитов из костного мозга впериферическую кровь). Фактором,приводящим к увеличению значения %-огосодержания ретикулоцитов могут бытьприем следующих препаратов: кортикотропин,противомалярийные лекарственныесредства, жаропонижающие препараты,фуразолидона (у маленьких детей),леводопы. Запомните:ретикулоцитоз, без соответствующейэритронормобластической реакциикостного мозга, наблюдается прираздражении отдельных участков егораковыми метастазами или воспалительнымиочагами. Возможнойошибкой при подсчете ретикулоцитовможет быть их ложное завышение из-заналичия: •включений в эритроцитах (тельца Жолли,малярийные паразиты); •высокого лейкоцитоза;•аномальной формы гемоглобина;•гипертромбоцитоза;•гигантских тромбоцитов. Снижениеколичества или отсутствие ретикулоцитов(ретикулоцитопения) наблюдается:•при арегенераторных апластических игипопластических анемиях; •при анемиях, вызванных недостаточностьюсодержания железа, витамина B12, фолиевойкислоты (микроцитарно-гипохромные имегалобластные анемии); •при талассемии; •при сидеробластной анемии; •при метастазах рака в кость; •при лучевой болезни и лучевой терапии; •при лечении цитостатиками;•при аутоиммунных заболеваниях системыкроветворения; •при заболеваниях почек; •при алкоголизме; •при рецидиве анемии Аддисона-Бирмера;•при микседеме. Факторы,искажающие результат лабораторногоисследования %-ого содержанияретикулоцитов:•неправильный выбор антикоагулянта илинедостаточное перемешивание крови сантикоагулянтом;•длительное сдавливание руки жгутом; •прием сульфаниламидов (возможны какзаниженные, так и завышенные результаты); •переливание крови незадолго доисследования;•гемолиз пробы крови. Показанияк назначению анализа на ретикулоциты: •оценка активности эритропоэза присостояниях, сопровождающихся гемолизомили кровопотерей;•ценка способности костного мозга крегенерации после цитотоксическойтерапии и трансплантации костногомозга;•ценка восстановления синтеза эритропоэтинапосле трансплантации почки;•допинговый контроль у спортсменов(прием эритропоэтина);•диагностика неэффективного гемопоэзаили снижения продукции эритроцитов;•дифференциальная диагностика анемий;•детекция нарушения регенераторнойспособности костного мозга при дефицитежелеза, витаминов B12, B6, фолатов, меди имониторинга соответствующей терапии;•оценка реакции на терапию эритропоэтином,эритросупрессорами.

МЕТОДЫПОДСЧЕТА КОЛИЧЕСТВА РЕТИКУЛОЦИТОВ

(1) Подсчетколичества ретикулоцитов в мазке послеокраски их специальными красителями. Данныйметод является на практике наиболееиспользуемым методом в связи с тем, чтоон простой, достаточно дешевый и нетребует специального дорогостоящегооборудования, соответственно можетприменяться в любой клинико-диагностическойлаборатории.

Принципметода основан на выявлении зернисто-сетчатойсубстанции ретикулоцитов при суправитальнойокраске щелочными красками (насыщенныйраствор бриллиантового крезиловогосинего в абсолютном спирте / растворазура I /раствор азура II) с дальнейшимподсчетом их в мазке крови. Окраскуретикулоцитов проводят либо на стекле,либо в пробирке.

Подсчетосуществляют с помощью микроскопа:приготовленные одним из указанных вышеспособов мазки микроскопируют симмерсионным объективом; в мазкеретикулоциты и эритроциты окрашены вжелтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатаясубстанция в ретикулоцитах – в синий(при окраске азуром II и бриллиантовымкрезиловым синим) или синевато-фиолетовыйцвет (при окраске азуром I).

(2) Подсчетколичества ретикулоцитов при помощилюминесцентной микроскопии.

Данныйметод отличается простотой и требуетнемного времени, более точен по сравнениюс обычным методом, так как при люминесцентноймикроскопии обнаруживаются мельчайшиезерна сетчато-нитчатого вещества, однакоон возможен только при наличиилюминесцентного микроскопа и специальныхкрасителей, в связи с чем доступен лишьнемногим лабораториям.

Принципподсчета количества ретикулоцитов припомощи люминесцентной микроскопииоснован на использовании способностисубстанции ретикулоцитов флюоресцироватьпосле обработки крови акридиновыморанжевым. Кровь смешивают с акридиновыморанжевым в пробирке или смесителе всоотношении 1 часть крови и 10 частейкраски (смесь можно хранить не более 5часов).

Смесь перемешивают в течение 2минут, каплю смеси наносят на предметноестекло и накрывают покровным стеклом.При этом жидкость не должна выходитьза пределы покровного стекла. Микроскопируютс помощью светофильтра ЖС-17.

В препаратеэритроциты имеют темно-зеленые очертанияи не флюоресцируют, а в ретикулоцитахзернисто-сетчатая субстанция светитсяярко-красным цветом, благодаря чемуретикулоциты легко подсчитать. В крови,стабилизированной гепарином или цитратомнатрия, флюоресценции ретикулоцитовне наблюдается.

(3) Автоматическийподсчет количества ретикулоцитов спомощью гематологического анализатора. Всовременных гематологических анализаторахтехнология подсчета форменных элементовкрови основана на кондуктометрическомметоде, предложенном H. Wallace и Joseph R. Culterв 1947 г.

Принцип метода заключается вподсчете числа и определении характераимпульсов, возникающих при прохожденииклетки через отверстие малого диаметра(апертуру), по обе стороны которогорасположены два изолированных друг отдруга электрода. Каждое прохождениеклетки через апертуру сопровождаетсяпоявлением электрического импульса,который регистрируется электроннымдатчиком.

Разделение клеток по категориям(эритроциты, лейкоциты, тромбоциты,осадок) осуществляется прибором наосновании анализа амплитуды полученныхимпульсов.Чтобы определить концентрациюклеток, достаточно пропустить определенныйобъем пробы через канал и подсчитатьколичество импульсов, которые при этомгенерируются.

Следуетобратить внимание на то, что помимоклассического параметра ретикулоцитов- относительное (%) содержание ретикулоцитов(RET%, percent of reticulocytes), определяемого спомощью 1 и 2 методов лабораторнойдиагностики, в связи с появлениемвысокотехнологичных гематологическиханализаторов (3 метод) стало возможнымполучать (например, с помощьюзапатентованного флюоресцентногокрасителя для анализатора Sysmex -XT- 2000i)дополнительные информативныеретикулоцитарные параметры:• ретикулоцитыс низким содержанием РНК, наиболеезрелые (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракцияретикулоцитов с низкойфлуоресценцией);• ретикулоцитысо средним содержанием РНК (MFR%,medium fluorescence reticulocyte fractions) – фракцияретикулоцитов со среднейфлуоресценцией);• ретикулоцитыс высоким содержанием РНК (HFR%,high fluorescence reticulocyte fractions) – фракцияретикулоцитов с высокойфлуоресценцией);• незрелаяфракция ретикулоцитов (IRF%,Immature Reticulocyte Fraction). Дифференцировкаретикулоцитов, основанная на степенизрелости и, соответственно, содержаниинуклеиновых кислот, является отражениемгемопоэтической активности костногомозга. Методика(анализатор Sysmex -XT- 2000i). В проточнойкювете клетки пересекают лучполупроводникового лазера, при этомпроисходит рассеивание луча под большими малым углами и возбуждение флюоресцентногокрасителя. Это позволяет определятьразличные стадии зрелости ретикулоцитовпо содержанию РНК в клетках и интенсивностиих свечения. Автоматизированный подсчетретикулоцитов отличается высокойточностью (подсчитывается более 30 000эритроцитов) и воспроизводимостью(коэффициент вариации составляет около6%). Данная технология обеспечиваетточный подсчет ретикулоцитов даже приих предельно низких концентрациях.

Ретикулоцитопении и ретикулоцитозы, причины развития, диагностическое значение их выявления.

Источник: https://studfile.net/preview/5844876/page:15/

Подсчет количества ретикулоцитов крови при анемиях

Ретикулоциты – молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие в их цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции (ретикулума), представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии.

1.) Подсчет количества ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями.

Данный метод является на практике наиболее используемым методом в связи с тем, что он простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, соответственно может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории.

Принцип метода основан на выявлении зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками (насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте / раствор азура I /раствор азура II) с дальнейшим подсчетом их в мазке крови. Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке.

Подсчет осуществляют с помощью микроскопа: приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом; в мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I).

2.) Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии.

Данный метод отличается простотой и требует немного времени, более точен по сравнению с обычным методом, так как при люминесцентной микроскопии обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества, однако он возможен только при наличии люминесцентного микроскопа и специальных красителей, в связи с чем доступен лишь немногим лабораториям.

Принцип подсчета количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии основан на использовании способности субстанции ретикулоцитов флюоресцировать после обработки крови акридиновым оранжевым.

Кровь смешивают с акридиновым оранжевым в пробирке или смесителе в соотношении 1 часть крови и 10 частей краски (смесь можно хранить не более 5 часов). Смесь перемешивают в течение 2 минут, каплю смеси наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом.

При этом жидкость не должна выходить за пределы покровного стекла.

Микроскопируют с помощью светофильтра ЖС-17. В препарате эритроциты имеют темно-зеленые очертания и не флюоресцируют, а в ретикулоцитах зернисто-сетчатая субстанция светится ярко-красным цветом, благодаря чему ретикулоциты легко подсчитать. В крови, стабилизированной гепарином или цитратом натрия, флюоресценции ретикулоцитов не наблюдается.

3.) Автоматический подсчет количества ретикулоцитов с помощью гематологического анализатора.

В современных гематологических анализаторах технология подсчета форменных элементов крови основана на кондуктометрическом методе, предложенном H. Wallace и Joseph R. Culter в 1947 г.

Каждое прохождение клетки через апертуру сопровождается появлением электрического импульса, который регистрируется электронным датчиком. Разделение клеток по категориям (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, осадок) осуществляется прибором на основании анализа амплитуды полученных импульсов.

Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать количество импульсов, которые при этом генерируются.

Следует обратить внимание на то, что помимо классического параметра ретикулоцитов – относительное (%) содержание ретикулоцитов (RET%, percent of reticulocytes), определяемого с помощью 1 и 2 методов лабораторной диагностики, в связи с появлением высокотехнологичных гематологических анализаторов (3 метод) стало возможным получать (например, с помощью запатентованного флюоресцентного красителя для анализатора Sysmex -XT- 2000i) дополнительные информативные ретикулоцитарные параметры: • ретикулоциты с низким содержанием РНК, наиболее зрелые (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с низкой флуоресценцией); • ретикулоциты со средним содержанием РНК (MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions) – фракция ретикулоцитов со средней флуоресценцией); • ретикулоциты с высоким содержанием РНК (HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions) – фракция ретикулоцитов с высокой флуоресценцией);

• незрелая фракция ретикулоцитов (IRF%, Immature Reticulocyte Fraction).

Дифференцировка ретикулоцитов, основанная на степени зрелости и, соответственно, содержании нуклеиновых кислот, является отражением гемопоэтической активности костного мозга.

Методика (анализатор Sysmex -XT- 2000i). В проточной кювете клетки пересекают луч полупроводникового лазера, при этом происходит рассеивание луча под большим и малым углами и возбуждение флюоресцентного красителя.

Это позволяет определять различные стадии зрелости ретикулоцитов по содержанию РНК в клетках и интенсивности их свечения. Автоматизированный подсчет ретикулоцитов отличается высокой точностью (подсчитывается более 30 000 эритроцитов) и воспроизводимостью (коэффициент вариации составляет около 6%).

Данная технология обеспечивает точный подсчет ретикулоцитов даже при их предельно низких концентрациях.

Источник: https://cyberpedia.su/10x91ee.html

Источник: sampomosh.ru

Прижизненная (суправитальная) окраска ретикулоцитов

Для этого способа необходимы следующие реактивы:

Абсолютный этиловый спирт: в сухую с притертой пробкой посуду помещают прокаленную безводную (белого цвета) сернокислую медь и приливают 1/4 часть абсолютного спирта. Содержимое взбалтывают. Абсолютный спирт (спирт, не содержащий воды) можно получить обезвоживая спирт сернокислой медью, предварительно прокаленной. Обезвоживание прекращают тогда, когда сернокислая медь перестает голубеть.
Насыщенный раствор бриллианткрезиловой синьки в абсолютном спирте: к 80 мл абсолютного спирта прибавляют 1 г бриллианткрезиловой синьки.
Азур I.

Техника прижизненной окраски и подсчета ретикулоцитов

Предметные стекла заранее покрывают насыщенным раствором бриллианткрезиловой синьки. Свежевыступившую каплю крови распределяют по предметному стеклу с краской, как при приготовлении мазка крови. Препарат немедленно помещают на 6-8 минут во влажную камеру, после чего высушивают на воздухе и микроскопируют (окуляр 7Х, объектив 90X с поднятым конденсором). Ретикулоциты подсчитывают точно так же, как тромбоциты, с ограничителем поля зрения. Ретикулоциты, окрашенные бриллианткрезиловой синькой, бледно-зеленые с сеточкой голубого или синего цвета (см. рис.).

Ретикулоциты, окрашенные бриллианткрезиловой синькой

Вместо бриллианткрезиловой синьки для окраски ре тикулоцитов можно использовать, согласно прописи Магиной, краску азур I (1 г азура I на 40 мл абсолютного спирта; выдерживают при комнатной температуре 2 дня).

Одновременная суправитальная окраска тромбоцитов и ретикулоцитов по Алексееву

Для этого способа применяют краску Алексеева. В колбу емкостью 100 мл насыпают 1 г краски азур II и добавляют приготовленный в отдельной колбе реактив следующего состава: 5 г лимоннокислого натрия, 4 г хлористого натрия и 45 мл дистиллированной воды. Содержимое колбы медленно нагревают на асбестовой сетке при постоянном помешивании, не доводя до кипения. Охлаждают, фильтруют. Фильтрат используют в качестве рабочего раствора краски.

Техника одновременной окраски и подсчета тромбоцитов и ретикулоцитов

В смеситель для лейкоцитов до метки 1,0 набирают краску Алексеева, вытирают кончик от краски и кладут на стол. Производят более глубокий, чем обычно, укол в палец. Кровь набирают до 4/5 объема расширенной части смесителя, следя за тем, чтобы в нее не попадали пузырьки воздуха. Кровь быстро выдувают из капиллярной части смесителя на ватку, а остальное содержимое — в луночку предметного стекла. С луночки жидкость вновь набирают в смеситель. Двух-, троекратным повторением этой манипуляции смешивают кровь с реактивом. Набрав последний раз жидкость в смеситель, его оставляют в горизонтальном положении на 15-30 минут для окрашивания ретикулоцитов и тромбоцитов. Затем смеситель встряхивают в течение минуты и выпускают 1-2 капли. Из последующих капель готовят тонкие мазки. Препараты высушивают на воздухе, фиксируют метиловым спиртом и докрашивают краской Романовского в разведении 1-2 капли на 1 мл воды в течение 35-45 минут. Краску смывают водой, а мазки высушивают и микроскопируют. В мазке, окрашенном по Алексееву, ретикулоциты розовые с сеточкой синего цвета (см. рис.), а тромбоциты голубовато-сиреневого цвета.

Ретикулоциты, окрашенные по Алексееву

Подсчет ретикулоцитов и тромбоцитов производят одновременно на 1000 эритроцитов так же, как описано в теме «Тромбоциты». Результаты для ретикулоцитов выражают в promille; тромбоциты рассчитывают на 1 мм3 крови (для расчета учитывают количество эритроцитов, подсчитанных у данного больного).

В крови здоровых лиц насчитывают 5-10 % ретикулоцитов.

Источник: ginekolog.my1.ru