Изоферментный спектр


1

  • Авторы
  • Резюме
  • Файлы
  • Ключевые слова
  • Литература

Пероксидаза (ПО; КФ 1.11.1.7) относится к классу оксидоредуктаз. Основная функция ПО – катализировать окисление химических соединений за счет пероксидного кислорода с образованием промежуточных комплексов [1].

Пероксидазы подразделяются на два семейства – животные и растительные [2]. Семейство растительных пероксидаз состоит из трех классов, выделяемых на основании исследований аминокислотных последовательностей ферментов [3]. К первому классу растительных ПО относятся внутриклеточные ферменты: аскорбатпероксидаза, бактериальная каталаза-пероксидаза и дрожжевая цитохром-с-пероксидаза, второй класс включает секретируемые грибные ферменты, а к третьему классу относятся секретируемые пероксидазы растений [4].

Пероксидаза является одним из ферментов, участвующих в регуляции роста и развития растительных организмов, поскольку катализирует защитные реакции от повреждений различного типа, а также участвует в формировании клеточной стенки и дыхании растений [5–7].


казана ее роль в образовании ауксина, этилена, восстановлении нитратов и нитритов, то есть в азотном обмене, ростовых процессах [8]. В присутствии ПО регулируется созревание и старение тканей, синтез лигнина [8]. ПО – наиболее часто изучаемый фермент при анализе сомаклональной изменчивости, возникающей в культуре ткани в условиях in vitro [9]. Кроме того, энзим является чувствительным к разного рода неблагоприятным воздействиям и широко используется исследователями для оценки чувствительности/устойчивости к стрессу [10–12]. ПО является индуцибельным ферментом, индуктором которого могут служить физические, химические и биологические факторы. Кислые и основные пероксидазы участвуют в ответных реакциях при стрессовом состоянии растительного организма. В самом начале активируются основные ПО, а изменения, связанные с метаболизмом ауксина и этилена, индуцируют усиление синтеза кислых ПО как более поздний шаг ответа или защиты.

Пероксидазную активность определяют не только для анализа метаболизма растений, но и в клинико-биохимических исследованиях патологических процессов животных тканей, для диагностики хронических и острых, а также аллергических заболеваний. Кроме того, лиофилизированные препараты ПО используются для диагностики бактериальных, аллергических, аутоиммунных и онкологических заболеваний, включая СПИД и лепру [13–18].


В настоящее время существует множество методов определения активности и выявления изоферментного спектра пероксидаз; некоторые методики весьма трудоемки, малочувствительны, дают противоречивые результаты [19–22]. Разнообразие методик определяется широкой субстратной специфичностью пероксидазы, поскольку фермент проявляет активность в присутствии пероксида водорода по отношению ко многим фенолам и ароматическим аминам: двухатомному фенолу пирокатехину (о-диоксибензолу), монометиловому эфиру пирокатехина – гваяколу, оксипроизводному нафталина – 1-нафтолу, 4,4′-диаминодифенилу, известному как бензидин, а также производному бензидина – 3,3′-диметоксибензидину (о-дианизидину), 2,2-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой) кислоте (АБТС) и многим другим [1, 21]. Таким образом, фермент является строго специфичным по отношению к перексиду водорода и широко специфичным – к другим субстратам [1]. Активность изоформ фермента также зависит от природы субстратов, а физиологические функции отдельных форм значительно отличаются. Отмечена видовая, органная, тканевая, внутриклеточная специфичность ПО [1].

В связи со значительным многообразием методов определения активности и выявления изоферментного спектра пероксидазы с применением различных субстратов целью настоящей работы явился обзор собственных 15-летних исследований, а также работ других авторов для выявления наиболее быстрого, незатратного, чувствительного способа в оптимальных субстратных условиях.


Объекты исследования

Обсуждаемые в обзоре эксперименты по определению активности и изоферментного спектра пероксидазы выполнены с использованием культурального фильтрата корневой губки различных штаммов (Heterobasidion annosum (Fr.) Bref.), почек дуба черешчатого (Quercus robur L.), листьев вяза обыкновенного (Ulmus laevis L.), микроклонов карельской березы (Betula pendula Roth var carelica Merkl.) и березы повислой (Betula pendula Roth), а также вейгелы цветущей «вариегата» (Weigela florida «Variegata» Bunge A.D.C.), хвои сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), трансгенных растений сахарной свеклы (Beta vulgaris L.), сыворотки крови людей, больных артериальной гипертензией.

Получение ферментных препаратов из растительных тканей

Для получения растительных ферментных экстрактов навеску растительного материала растирают с битым песком в экстрагирующем буфере (0,1 М трис-НСl буфер, рН 7,5). Соотношение навески и буфера составляет в зависимости от образца от 1:4 до 1:10 (w/v). Гомогенат центрифугируют в эппендорфах в течение 10 минут при 20000 g, + 4 °С, на центрифуге СМ50 ELMI (Латвия). Надосадочные жидкости сохраняют при –3 °С в твердотельном термостате BIOSAN CH-100 (Латвия).

Буферы для определения активности пероксидазы

В зависимости от оптимума рН фермента используют 0,1 М ацетатный буфер в диапазоне рН 3,6–5,6; 0,1 М цитратный буфер (лимонная кислота / натрий лимоннокислый), pH 3,0–6,6; буфер Мак-Ильвейна (Na2HPO4/лимонная кислота) рН 3,0–6,3; 0,1 М трис-НСl – рН 7,2–9,0.


Молярность буфера. При изучении влияния молярности буфера на активность фермента установлено, что максимальная активность ПО в реакции с бензидином наблюдалась в 100–200 mM (0,1–0,2 М) трис-НСl буфере при рН 7,0.

Субстраты для определения активности пероксидазы

В проведенных нами экспериментах кинетика насыщения фермента субстратами имела вид равнобочной гиперболы, поэтому константы Михаэлиса определяли по методу двойных обратных величин (координаты Лайнуивера – Берка) [23]. Каталитическую активность устанавливают на основании детекции окрашенных продуктов реакции при 25 °С. Субстратная смесь состояла из 0,05 мл 0,1 % водного раствора АБТС (конечная концентрация 30 мкМ), 2,9 мл буфера, измерение оптической плотности проводят при длине волны 436 нм.

В реакции с пирокатехином для определения активности ПО используют 5 % водный раствор пирокатехина в 0,1 М буфере Мак-Ильвейна (конечная концентрация 41,3 mM). Определение активности проводят при длине волны 365 нм.

Для определения активности ПО в реакции с бензидином используют метод А.Н. Бояркова, разработанный впервые при использовании ФЭКа в 1951 г. [24]. Бензидиновый реактив включает два компонента [25]. Первый состоит из 50 % спиртового раствора 0,1 % бензидина солянокислого, содержащего 6 % ацетата натрия, 3 % уксусной кислоты.
нечная концентрация бензидина в реакционной смеси – 5,8 mM. Вторым компонентом является 0,5 % раствор пероксида водорода (конечная концентрация 0,3 mM). Значение рН бензидинового реактива составляет менее 2,0 единиц рН, а предварительные исследования выявили рН-оптимум действия ПО, равный 7,0. Поэтому первый компонент бензидинового реактива доводят до нейтрального значения рН растертым в порошок (для неизменности объема смеси) кристаллическим NaОН. Приготовленная таким образом основа бензидинового реактива может храниться в холодильнике при 0–4 °С в течение года. Для упрощения процедуры измерения активности ПО в кварцевую кювету вносят 3 мл первого компонента бензидинового реактива, предварительно согретого до комнатной температуры, и добавляют 18 мкл Н2О2. Измерения проводят при 520 нм.

Выявление изоферментного спектра пероксидаз

Изоферментный спектр ПО выявляют с использованием бензидинового реактива, о-дианизидина, α-нафтола.

Состав и методика применения бензидинового реактива описаны выше.

Х.С. Рафиковым впервые был использован для выявления пероксидазной реакции гаптоглобина крови о-дианизидин [26]. В состав проявляющей смеси входят 50 мл воды, 1 г о-дианизидина, 2,5 мл СН3СООН, 0,2 мл Н2О2. После появления оранжевых полос реакцию останавливают добавлением раствора 15 % уксусной кислоты.

Для приготовления проявляющей смеси с α-нафтолом берут 1 mM 1-нафтола в 0,1 М фосфатном буфере в присутствии 0,33 mM перекиси водорода. Данный метод используется, в частности, в клинико-диагностических лабораториях при цитохимическом диагностировании лейкозов [27].


Вертикальный электрофорез (ЭФ) проводят по стандартному методу Дэвиса в пластинах полиакриламидного геля (7,5 % по акриламидной смеси) при 4 °С. К 0,05–0,2 мл ферментного образца добавляют в качестве антиконвекционной смеси глицерин до конечной концентрации 20 %, в карман геля вносят 20 мкл пробы, в качестве лидирующего красителя используют бромфеноловый синий.

Выявление зон активности проводят по Левитесу [28], Божко [29], Рафикову [30], Юренковой [31, 32]. Гели высушивают на стеклянных пластинах, в целлофане (Балаково), в растворе спирт: глицерин (1:1), а затем сканируют с разрешением 300dpi на сканере HP Scanjet 3770 в окне для прозрачных материалов. Гели хранят в темноте.

Экстракция пероксидаз из различных тканей

Растительные пероксидазы высокостабильны, поэтому в состав экстрагирующего буфера входит только трис-НСl, рН 7.0. Добавление ЭДТА, меркаптоэтанола, хлорида калия, а также поливинилпирролидона не влияет на изменение активности фермента (рис. 1).

Кроме того, можно отметить нейтральное влияние длительности экстракции фермента (от 30 мин до 12 часов) из сосновой хвои, считающейся труднодоступной для извлечения ферментов, на активность ПО. Полученный после центрифугирования супернатант обнаруживал стабильную активность и неизменность изоформ ПО в течение по крайней мере недели, при этом хранение препарата осуществлялось при 0 °С в присутствии 20 % глицерина.


Нами было установлено, что оптимум рН для ПО из корневой губки в присутствии АБТС в цитратном, ацетатном и буфере Мак-Ильвейна сдвинут в кислую сторону (рН 4,5–5,5). В трис-НСl буфере в присутствии бензидина оптимум рН составляет 7,0–7,5, а в буфере Мак-Ильвейна в присутствии пирокатехина – 6,0–6,5. В буфере Мак-Ильвейна оптимум рН более широкий, и активность пероксидазы в этой системе в 1,3 раза выше по сравнению с цитратным буфером (рис. 2). Можно предположить, что такое увеличение активности фермента связано с присутствием ионов неорганического фосфора в составе буфера Мак-Ильвейна. Активность ПО в культуральном фильтрате (КФ) корневой губки ниже активности фермента в цитратном буфере в 9,7 раз.

В связи с этим было изучено влияние HPO42—ионов на активность ПО корневой губки посредством добавления к цитратному буферу соли Na2HPO4. Добавление 0,5 мМ соли приводит к падению активности фермента до ее уровня в КФ. Увеличение концентрации соли до 1,0 и 2,0 мМ повышало активность ПО до уровня ее показателей в цитратном буфере. Дальнейшее повышение концентрации ионов фосфора (3,0 мМ) приводит к падению активности фермента. Таким образом, действие буфера Мак-Ильвейна высокоспецифично и отличается от простого влияния ионов фосфора на активность энзима. Отмечено, что влияние фосфата натрия проявляется только в условиях буферной системы, а его добавление в концентрации 1 мМ непосредственно к культуральному фильтрату штаммов (контроль) приводило к полной потере активности ферментного препарата.


Наивысшая активность пероксидазы проявляется при молярности трис-НС1 буфера (рН 7,0), составляющей 100 мМ и выше (рис. 3).

Методы определения активности пероксидаз

Принципы методов определения активности ПО основаны на появлении окрашенных продуктов при окислении субстратов под действием пероксидазы, регистрируемых по увеличению оптической плотности при соответствующей длине волны. Одной из важнейших характеристик любого фермента является специфичность его действия по отношению к субстрату. Анализ кинетических характеристик показал, что скорость окисления пирокатехина в КФ корневой губки (Km 29 мM) оказалась на порядок ниже скорости окисления АБТС (Km 40–60 мкМ для разных штаммов), хотя молекула пирокатехина (о-диоксибензол) является фенольным производным и по своему строению проще молекулы АБТС. Скорость окисления бензидина, измеренная в хвое сосны, почках дуба и микроклонах березы и сахарной свеклы, оказывается промежуточной: Km в 0,1 М трис-НС1 буфере при рН 7,0 равна 0,3 mM.

Чувствительность реакции очень высока, поэтому объем используемого ферментативного экстракта мал (1–10 мкл), а время измерения активности фермента составляет не более 3 мин. В случае обнаружения чрезмерно высокой ферментативной активности препаратов их разбавляют 0,1 М трис-НС1 буфером, рН 7,0 для сохранения нормальных кинетических кривых или используют удвоенное количество перекиси водорода (36 мкл). Бензидиновый метод определения активности ПО представляется оптимальным в силу ряда причин: долговременного хранения базового реактива (около года при 0 °С), оптимальных условий рН, доступности компонентов и простоты измерения.


Анализ изоферментного спектра пероксидаз

а) Проявление с использованием бензидина

Для выявления изоформ пероксидазы растительного происхождения применяют бензидиновый реактив при рН 7,0. Перед окрашиванием геля компоненты бензидинового реактива смешивают в соотношении 1:1. После заливки геля бензидиновым реактивом окраска зон пероксидазной активности проявляется в зависимости от количества нанесенного фермента в течение 5–130 минут (рис. 4–6). Иногда гель оставляют в проявляющем растворе на ночь в темноте.

zem3.wmf

Рис. 3. Влияние молярности трис-НС1 буфера (рН 7,0) на активность пероксидазы из листьев березы повислой in vitro

Выявление изоформ пероксидазы бензидиновым методом позволяет получить достаточно широкий спектр зон фермента.

Этот метод, однако, не подходит для выявления зон гаптоглобина сыворотки крови, т.к. не выявляет всех изоформ фермента [33]. Поэтому для выявления фенотипов гаптоглобина использовали еще два метода.

zem4.tif


Рис. 4. Изоферментный спектр ПО в зимних почках (А; февраль) и распускающихся листьях (Б; март, образование на почках зеленого конуса) дуба черешчатого [34]. Плюсовые деревья Шиповой дубравы, Воронеж

По первому из них, предложенному Г.Х. Божко с соавт. [29], проявление геля проводят с использованием бензидинового реактива, исключающего присутствие спирта и уксуснокислого натрия: пластины геля выдерживают в течение 10 мин в 0,1 % бензидине в 10 % уксусной кислоте, после чего гели перемещают в кюветы с 0,03 % раствором перекиси водорода. Окраска ферментативных полос стремительно развивается, но после промывания в воде синяя окраска фермента переходит в коричневую, становится нестабильной, а гели – непригодными для сушки.

zem5.tif

Рис. 5. Пероксидазный спектр растений-регенерантов березы различного происхождения в культуре in vitro [35]. Обозначения: 1–4 – карельская береза, узорчатая форма; 2 и 3 – карельская береза, триплоидная узорчатая форма; 4 – карельская береза, безузорчатая форма; 5 – береза повислая; 1 – каллус с регенерирующими побегами; 2 – регенерант; 3 – каллус; 4 – регенерант без корней; 5 – регенерант без корней

zem6.tif

Рис. 6. Изоферментный спектр ПО в различных линиях трансгенной сахарной свеклы in vitro [36], выявленный с помощью бензидина. Обозначения: 1 – контроль; 2–10 – опыт

Другим способом выявления спектров гаптоглобина по пероксидазной активности является метод, предложенный Х.С. Рафиковым [30]. Он включает выдерживание гелей в растворе, содержащем 50 мг бензидина, 135 мг гваякола, 25 мл 10 % уксусной кислоты, перед применением раствор разводят водой в соотношении 1:5. К 10 мл бензидин-гваяколового реактива добавляют дополнительно 1 мл 0,2 М ацетата натрия, 0,1 мл 5 мM сульфата марганца и 1 каплю 50 % перекиси водорода. Время проявления составляет 10–20 мин. Реакцию останавливают 15 % уксусной кислотой. Учитывая сложность приготовления проявляющей смеси, в дальнейшем стали применять о-дианизидин, который обычно используют для выявления активности фермента в культуральной жидкости дереворазрушающих и других грибов – представителей белой и коричневой плесеней [33]. Исходя из литературных данных, проявляющая смесь для выявления пероксидазной активности для сыворотки крови состоит из 1 г о-дианизидина, 2,5 мл уксусной кислоты, 0,2 мл перекиси водорода в 50 мл воды. Зоны фермента приобретали красный цвет на фоне темно-вишневого фона геля (рис. 7).

zem7.tif

Рис. 7. Электрофореграммы гаптоглобинов сыворотки крови у 20 человек, больных артериальной гипертензией [37]. Обозначения: Типы гаптоглобинов: Нр 1–1–дорожки (слева направо) 1, 3–8, 11, 15–16, 18, 20; Нр 1–2 – дорожки 2, 10, 12–14, 19; Нр 2–2 – дорожки 9, 17

Способ выявления изоформ ПО с помощью о-дианизидина применялся нами и для сравнения спектра фермента из спящих и пробуждающихся почек дуба черешчатого. Результаты приведены на рис. 8.

В руководстве Левитаса [28] описан метод выявления изоформ ПО с помощью 0,1 М гваякола (100 мл) в сочетании с 1–3 мл 3 % перекиси водорода. Однако автор указывает, что окраска нестойкая. Этот же автор описывает и бензидиновый способ проявления гелей на ПО-активность при рН 5,0, при этом гель фиксируют в метаноле.

Кроме того, существует способ выявления активности пероксидазной активности в гелях, описанный в статье С.И. Юренковой с соавт. [31] для электрофоретического выявления изоформ цитохром-с-оксидазы. Реакционная смесь для выявления зон фермента включает 1 мл 2 % спиртового раствора 1-нафтола, 25 мл водного раствора диметил-п-фенилендиамина солянокислого (20 мг), 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,4 до 50 мл. Однако при проявлении гелей на цитохром-с-оксидазу выявлялись полосы активности, совпадающие с таковыми при выявлении пероксидазной активности. Такие результаты были получены у почек дуба черешчатого, а также у микроклонально размноженных растений вейгелы цветущей «вариегата», адаптированных к медному и солевому стрессу в ходе длительной ступенчатой адаптации на протяжении 120 суток (рис. 9).

Полученные результаты позволяют нам предположить, что 1-нафтол в данном методе является субстратом для проявления активности ПО, а не цитохром-с-оксидазы.

zem9.tif

Рис. 9. Изоферментый спектр пероксидазы в микроклонах вейгелы цветущей «вариегата», адаптированных к солевому и медному стрессам. Обозначения: 1 и 2 – 40 и 120 суток адаптации, субстрат – 1-нафтол в фосфатном буфере; 3 и 4 – 40 и 120 суток адаптации, субстрат – бензидин; к – контроль, с – соль, м – медь. Стрелкой указано направление движения тока при электрофорезе

Изоформы пероксидазы могут быть выявлены разными способами, но при этом надо учитывать, что спектры фермента получаются различными, что связано со скоростью утилизирования субстрата теми или иными формами фермента. Представляется, что метод выявления активности фермента в гелях с помощью бензидина при рН 7,0 является более универсальным. При проявлении изоформ ПО с помощью о-дианизидина появляющиеся зоны менее стабильны, некоторые из них пропадают уже через несколько минут. Через сутки они практически полностью исчезают, тогда как в предыдущем случае, при правильном хранении, гели сохраняют окраску многие годы.

Таким образом, с помощью выявления изоформ ПО можно выявить отличия одного вида растений от другого, стадию регенерации растения, влияние стрессовых воздействий, онтогенетический возраст растения, независимо от того, древесное или травянистое растение берется для анализа.

Гаптоглобин является стрессовым белком крови человека и животных, обладающим пероксидазной активностью [38]. По его количеству можно определить степень тяжести заболевания [39]. Имеют значения и типы гаптоглобина: они связаны с определенным заболеванием. Выявление фенотипов гаптоглобина используется как для выбраковки больных животных, так и для получения потомства от генетически здоровых родителей [40, 41]. При выявлении типов гаптоглобина также используется о-дианизидин.

Заключение

Таким образом, из проанализированных способов определения активности и выявления изоферментного спектра пероксидазы оптимальным представляется метод, основанный на применении бензидинового реактива в нашей модификации, связанной с повышением рН реактива до нейтральных значений (7,0), тогда как в классических методиках рН сильнокислый (2,0). Для электрофоретического выявления изоформ фермента растений бензидиновый способ является наиболее удобным, дешевым, позволяющим получать стабильную окраску гелей.


Библиографическая ссылка

Землянухина О.А., Калаев В.Н., Воронина В.С. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ И ИЗОФЕРМЕНТНОГО СПЕКТРА ПЕРОКСИДАЗ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ // Успехи современного естествознания. – 2017. – № 9. – С. 13-22;
URL: http://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=36534 (дата обращения: 18.09.2019).

Источник: natural-sciences.ru

Ферменты, катализирующие одну и ту же химическую реакцию, но отличающиеся по первичной структуре белка, называют изоферментами.

 

Нарушения функционирования ферментов в клетке — энзимопатии.

Все изоферменты одного и того же фермента выполняют одну и ту же каталитическую функцию, но могут значительно различаться по степени каталитической активности, по особенностям регуляции или другим свойствам.

Строение изоферментов: ЛактатДигидроГеназа 1-5.

Появление ЛДГ в крови свидетельствует о повреждении органов (фермент из разрушенных клеток поступает в кровь – гиперферментемия) Повышение активности фракции ЛДГ1 в крови наблюдается при повреждении сердечной мышцы (инфаркт миокарда), а повышение активности ЛДГ5 в крови наблюдается при гепатитах и повреждении скелетных мышц.

 

 

3. Гипо- и авитаминозы. Экзо- и эндогенные причины нарушения баланса витаминов в организме, последовательность, подходы к профилактике гиповитаминов.

гиповитаминозы (количество витаминов снижено);

авитаминозы (полное отсутствие тех или иных витаминов).

Гиповитаминозы чаще отличаются стертой симптоматикой, появляющейся постепенно. Для авитаминозов же характерна достаточно яркая специфичная клиническая картина (хотя сейчас они наблюдаются крайне редко).

Витаминная недостаточность может образоваться из-за:

 

— дефицита витаминов в потребляемой пище (мало ягод, овощей, зелени, фруктов, преобладание рафинированных продуктов и др.);

— длительной нехватки белков

— избытка сахаров (страдает содержание В1);

— недостатка солнечного света или искусственного ультрафиолета;

— некомпенсированной повышенной потребности

 

При недостатке витаминов, наблюдается:

 

— поражение языка (гиповитаминоз В2, РР, В12, В6, Н);

— нарушения зрения (нехватка В2, А) и поражение глаз: блефарит, конъюнктивит (дефицит В2, Н, фолиевой кислоты, А);

— частые простуды и другие инфекции (недостаток В9, С, А);

— задержка роста (гиповитаминоз В9);

— необъяснимая усталость (дефицит Н, аскорбиновой кислоты);

— повышенная кровоточивость

 

Лечение: вся натуральная пища служит своеобразным поставщиком витаминов.

 

Билет № 4

Вопрос 1.

А) Глобулярные белки́ — белки, в молекулах которых полипептидные цепи плотно свёрнуты в компактные шарообразные структуры — глобулы (третичные структуры белка)

Глобулярная структура белков обусловлена гидрофобно-гидрофильными взаимодействиями.

К глобулярным белкам относятся: ферменты, иммуноглобулины, некоторые гормоны белковой природы (например, инсулин) а также другие белки, выполняющие транспортные, регуляторные и вспомогательные функции.

 

Фибриллярные белки — белки, имеющие вытянутую нитевидную структуру, в которой отношение поперечной оси к продольной больше 1:10. Большинство фибриллярных белков не растворяется в воде, имеет большую молекулярную массу и высоко регулярную пространственную структуру, которая стабилизируется, главным образом, взаимодействиями (в том числе и ковалентными) между различными полипептидными цепями. Первичная и вторичная структура фибриллярного белка также, как правило, регулярна. Полипептидные цепи многих фибриллярных белков расположены параллельно друг другу вдоль одной оси и образуют длинные волокна (фибриллы) или слои.

К фибриллярным белкам относят:

α-структурные фибриллярные белки (кератины, на долю которых приходится почти весь сухой вес волос и других роговых покровов, тропомиозин, белки промежуточных филаментов)

β-структурные фибриллярные белки (фиброин шёлка)

коллаген — белок сухожилий и хрящей.

1 Происхождение названия Лат. globulus — шарик Лат. fibrilla — волоконце, ниточка
2 Форма молекул Полипептидные цепи плотно скрученные в шаровидные или овальные структуры — глобулы Полипептидные цепи расположены параллельно друг другу и образуют длинные волокна (фибриллы) или слой
3 Механические свойства Неспособные к сжатию и распрямлению Способны к сжатию и распрямлению
4 Растворимость в воде Водорастворимые Нерастворимые в воде
5 Функции Выполняют преимущественно динамическую функцию Выполняют преимущественно структурные функции
6 Примеры Ферменты, антитела, белки молока, некоторые гормоны, гемоглобин Белки соединительной ткани (коллаген, оссеин), волосы (кератин), мышц (миозин), шелка (фиброина)

 

Б) Доменная структура и ее роль в функционировании белков.

Длинные полипептидные цепи глобулярных белков часто складываются в несколько компактных, относительно независимых областей. Они имеют самостоятельную третичную структуру, напоминающую таковую у глобулярных белков, и называются доменами.Благодаря доменной структуре белков легче формируется их третичная структура.

В доменных белках центры связывания с лигандом часто располагаются между доменами. Так, трипсин — протеолитический фермент, который вырабатывается экзокринной частью поджелудочной железы и необходим для переваривания белков пищи. Он имеет двухдоменное строение, а центр связывания трипсина с его лигандом — пищевым белком — располагается в бороздке между двумя доменами. В активном центре создаются условия, необходимые для эффективного связывания специфического участка пищевого белка и гидролиза его пептидных связей.

Разные домены в белке при взаимодействии активного центра с лигандом могут перемещаться друг относительно друга (рис. 1.15).

Гексокиназа— фермент, катализирующий фосфорилирование глюкозы с помощью АТФ. Активный центр фермента располагается в расщелине между двумя доменами. При связывании гексокиназы с глюкозой окружающие ее домены смыкаются и субстрат оказывается в «ловушке», где и происходит фосфорилирование (см. рис. 1.15).

Изоферментный спектр Рис. 1.15. Связывание доменов гексокиназы с глюкозой

В некоторых белках домены выполняют самостоятельные функции, связываясь с различными лигандами. Такие белки называются многофункциональными.

Вопрос № 2.

Ферменты по локализации делят на 3 группы:

 

I – общие ферменты (универсальные)

 

II — органоспецифические

 

III — органеллоспецифические

 

Общие ферменты обнаруживаются практически во всех клетках, обеспечивают жизнедеятельность клетки, катализируя реакции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот, образование биомембран и основных клеточных органелл, энергообмен. Общие ферменты разных тканей и органов, тем не менее, отличаются по активности.

 

Органоспецифичные ферменты свойственны только определенному органу или ткани. Например: Для печени – аргиназа. Для почек и костной ткани – щелочная фосфатаза. Для предстательной железы – КФ (кислая фосфатаза). Для поджелудочной железы – α-амилаза, липаза. Для миокарда – КФК (креатинфосфокиназа), ЛДГ, АсТ и т.д.

 

Внутри клеток ферменты также распределены неравномерно. Одни ферменты находятся в коллоидно-растворенном состоянии в цитозоле, другие вмонтированы в клеточных органеллах (структурированное состояние).

 

Органеллоспецифические ферменты. Разным органеллам присущ специфический набор ферментов, который определяет их функции.

Вопрос № 3.

Гипервитаминоз (лат. Hypervitaminosis) – острое расстройство организма в результате отравления (интоксикации) сверхвысокой дозой одного или нескольких витаминов, содержащихся в пище или витаминосодержащих лекарствах. Доза и конкретные симптомы передозировки для каждого витамина свои.

Гипервит. Д

Причины Гипервитаминоз Д может возникать по двум причинам: 1. Чрезмерное поступление вещества в организм путем введения специальных препаратов с лечебной или профилактической целью. Токсичной считается доза свыше 1 000 000 ME в сутки. 2. Повышенная индивидуальная чувствительность к витамину Д. В данном случае гипервитаминоз развивается даже на фоне приема умеренных доз витамина Д. Сверхчувствительность, как правило, наблюдается у детей, чьи матери принимали препараты витамина Д в период вынашивания, а также у детей, перенесших внутриутробное кислородное голодание или внутричерепную родовую травму. Повышенная чувствительность также характерна для детей с дисфункцией ЖКТ и хроническими заболеваниями почек

Осложнения и возможные последствия Гипервитаминоз витамина Д может быть чреват рядом негативных последствий. Основные из них: • мочекаменная болезнь; • почечная недостаточность (развивается в результате отложения кристаллов кальция в почках); • нарушение работы вилочковой и паращитовидной желез; • снижение иммунитета; • присоединение вторичной инфекции (пневмония, пиелонефрит); • токсический гепатит; • кальциноз сосудов; • миокардит. Хронический переизбыток вещества у детей может привести к развитию нефрокальциноза, хронического пиелонефрита с последующей хронической почечной недостаточностью, раннего атеросклероза. Гипервитаминоз Д в тяжелых случаях может приводить к летальному исходу

Гипервит. А

Что провоцирует / Причины Гипервитаминоза А:

Передозировка препаратов витамина А, употребление в пищу печени белого медведя, тюленя, кита, моржа, содержащей большое количество свободного витамина.

Симптомы Гипервитаминоза А:

Острый гипервитаминоз у взрослых характеризуется головной болью, тошнотой, рвотой, сонливостью, фотофобией, возможными тератогенными эффектами витамина А.

Острый гипервитаминоз А у детей. Обычно наблюдается в грудном возрасте при случайном или ошибочном введении витамина в избыточной дозе и проявляется гидроцефалией, выпячиванием родничка, лихорадкой, потерей аппетита, рвотой, повышением давления ликвора.

Хроническая интоксикация у детей и взрослых сопровождается пигментацией, шелушением и трещинами кожи, особенно ладоней и ступней, болями в костях и суставах при ходьбе, сухостью и ломкостью ногтей и волос и их выпадением, потерей аппетита и снижением массы тела, бессонницей, повышенной раздражительностью, гепато- и спленомегалией, тошнотой и рвотой.

 

                                                             

Билет 5

 

1. Четвертичная структура белка. Значение типов связей и ее фиксации.

 

Четверичная структура — взаимное расположение нескольких полипептидных цепей в составе единого белкового комплекса.

В состав белка с четвертичной структурой могут входить как идентичные, так и различающиеся полипептидные цепочки. В стабилизации четвертичной структуры принимают участие те же типы взаимодействий, что и в стабилизации третичной.

 

2. Зависимость скорости ферментативной реакции при температуре, pH, концентрации фермента, субстрата.

 

При увеличении температуры, увеличивается скорость (30-40)

При (50-60) происходит денатурация фермента.

При (80-90) происходит мгновенная денатурация.

 

рН

 Фермент действует при определенной рН от 6 до 8. Исключение рН2 – пепсин.

 

При увеличении количества молекул фермента скорость реакции возрастает непрерывно и прямо пропорционально количеству фермента, т.к. большее количество молекул фермента производит большее число молекул продукта

 

При увеличении концентрации субстрата скорость реакции сначала возрастает, затем наблюдается эффект насыщения, когда все молекулы фермента взаимодействуют с молекулами субстрата. При дальнейшем увеличении концентрации субстрата между его молекулами возникает конкуренция за активный центр фермента и скорость реакции снижается.

 

Вариант 6

Источник: studopedia.net

ИЗОФЕРМЕНТЫ (син.: множественные формы ферментов, изозимы) — молекулярные формы (разновидности) определенного фермента, отличающиеся только по физико-химическим свойствам; определение изофермент-ного спектра различных ферментов в сыворотке крови является одним из важных методов клин, энзимодиагностики. И. обнаружены в тканях человека, животных, растений и микроорганизмов. Известно св. 50 ферментов, представленных в виде И. в различных органах и тканях человека, животных и растений.

И. могут отличаться друг от друга по четвертичной структуре, т. е. по характеру и количеству субъединиц, входящих в состав их молекул, по электрофоретической подвижности, адсорбционным свойствам, сродству к субстрату, оптимальному значению pH, субклеточной локализации, специфичности в отношении коферментов (см.) и т. д. Так, напр., большинство органов и тканей человека и животных содержит пять И. лактатдегидрогеназы (ЛДГ), каждый из которых представляет собой различные комбинации из четырех субъединиц двух типов с мол. весом 34 500, условно обозначенных «Н» и «М» (см. Лактатдегидрогеназа). Оба типа субъединиц различаются по аминокислотному составу, последовательности остатков аминокислот в молекуле, иммунохим. и электрофоретическим свойствам. Синтез субъединиц контролируется двумя различными генами. Малатдегидрогеназа (МДГ) представлена в различных тканях человека и животных двумя И., один из которых локализован в митохондриях, а другой — в цитоплазме. Оба эти И. различаются по специфичности в отношении НАД и чувствительности к ингибиторам (напр., оксалату). И. изоцитратдегидрогеназы (ИЦДГ; КФ 1.1.1. 41 и 1.1.1.42) различаются по специфичности к коферментам (НАД и НАДФ), а также по субклеточной локализации: НАД-ИЦДГ локализована в митохондриях, а НАДФ-ИЦДГ и в митохондриях, и в цитоплазме. Митохондриальная и цитоплазматическая НАДФ-ИЦДГ различаются между собой по каталитическим, электрофоретическим и иммунохим. свойствам.

Для идентификации и разделения И. используют различные физ.-хим. методы исследования: различные виды электрофореза (см.), адсорбционную и ионообменную хроматографию (см.), гель-фильтрацию (см.) и др. Наиболее широкое распространение как самый доступный получил метод электрофореза в полиакриламидном геле (диск-электрофорез). Различия в электрофоретических свойствах являются основой для классификации многих И. Для обозначения И. приводится сокращенное название фермента с соответствующим подстрочным порядковым номером, который характеризует электрофоретическую подвижность И. при определенном значении pH. Напр., И. лактатдегидрогеназы обозначаются как ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3 и т. д.

Биол, значение наличия множественных форм ферментов еще не ясно. Предполагают, что И. играют определенную роль в регуляции метаболических процессов в клетке. Возможно, что И. обеспечивают приспособляемость организма к изменениям окружающей среды и обусловливают специфичность обмена, характерную именно для данной ткани. Поэтому многие ферменты, занимающие ключевые позиции в обмене веществ, имеют И. (ЛДГ, МДГ, ферменты, катализирующие окислительное фосфорилирование, различные аминотрансферазы). Возможно, что различные И. одного и того же фермента специфически катализируют прямую или обратную реакции определенной ферментативной реакции (см. Лактатдегидрогеназа). О важной роли И. в тонкой регуляции метаболических процессов свидетельствует изменение их спектра под влиянием ряда воздействий и физиол, факторов (денервации, различных гормонов, охлаждения, гипоксии и др.). Отмечено изменение в характере распределения различных И. в тканях человека и животных в эмбриогенезе. Однако для изученных ферментов пока не найдено специфических эмбриональных форм И.

Спектр И. в количественном и качественном отношении в различных тканях человека и животных различен и часто строго специфичен. Это имеет большое диагностическое значение. Поскольку биосинтез отдельных И. и их субъединиц контролируется различными генами, предполагают, что видоизменение гена влечет за собой появление атипичных И. в тканях и крови. Т. о., возникает возможность использования определения спектров И. для диагностики генетических аномалий. Ряд патол. процессов, особенно дегенеративно-деструктивного характера, связан с изменением проницаемости клеточных мембран, что является причиной изменения спектра И. в сыворотке крови больного. Поэтому определение И. в крови и тканях человека находит все более широкое применение в клинике. Для решения некоторых вопросов диагностики, патогенеза и терапии ряда заболеваний определение изоферментных спектров имеет существенное преимущество по сравнению с определением общей активности того или иного фермента. Наибольшее диагностическое значение имеет определение изофермент-ного спектра ЛДГ, который меняется при инфаркте миокарда (резко повышается активность ЛДГ1 и ЛДГ2). Изменения спектра И. ЛДГ в сыворотке крови сохраняются дольше, чем изменения суммарной активности фермента, и могут обнаруживаться тогда, когда общая активность ЛДГ возвращается к норме. Отклонения спектра И. ЛДГ от нормы отмечены при заболеваниях гепатобилиарной системы, при мышечных дистрофиях, опухолевых заболеваниях, остром лейкозе, патол, процессах в легких (острые очаговые и крупозная пневмонии, обострение хрон, пневмонии и др.)*

Диагностическим тестом служат также изменения спектров И. и других ферментов, напр, значительное увеличение катодных фракций МДГ (в особенности митохондриальной фракции) в сыворотке крови больных циррозом печени но сравнению с сывороткой крови больных хрон, гепатитом. Определение спектра И. и общей активности МДГ в крови находит широкое применение для диагностики и оценки тяжести асфиксии у новорожденных. Изменения активности И. кислой фосфатазы отмечаются при болезни Гоше (см. Гоше болезнь), раке предстательной железы и множественной миеломе. Для диагностики ряда заболеваний печени используют определение спектра И. щелочной фосфатазы (см. Фосфатазы).

Определение И. аминотрансфераз (см.) также имеет диагностическую ценность. В печени, почках, сердечной мышце человека обнаруживаются два И. аспартат-аминотрансферазы (КФ 2.6.1.1; АсАТ). Один из них локализуется в митохондриях, другой — в цитоплазме клеток. Ок. 79% всей активности АсАТ приходится на долю митохондриального И. и лишь 21% на долю цитоплазматического. При тяжелом течении болезни Боткина в сыворотке крови обнаруживается два И. АсАТ, тогда как в норме и при легком течении заболевания — только один.

При повреждениях скелетной мускулатуры, а также при инфаркте миокарда в сыворотке крови повышается активность креатинкиназы (см.), а также изменяется спектр ее И.

Библиография: Генетика изоферментов, под ред. Д. К. Беляева, М., 1977, библиогр.; Иванов И. И., Коровки н Б. Ф. и М а р к e л о в И. М. Введение в клиническую энзимологии), Л., 1974, библиогр.; Комаров Ф. И., Коровкин Б. Ф. и Меньшиков В. В. Биохимические исследования в клинике, Л., 1976; Ленинджср А. Биохимия, пер. с англ., с. 217 и др., М., 1976; Проблемы медицинской химии, под ред. В. С. Шапота и Э. Г. Ларского, с. 5, М., 1973; У и л к и н с о н Д. Изоферменты, пер. с англ., М., 1968; Успехи биологической химии, под ред. В. Л. Кретовича и др., т. 9, с. 55, М., 1972; Enzyme nomenclature, Amsterdam, 1965; К а р 1 a n N. О. Symposium on multiple forms of enzymes and control mechanisms, Bact. Rev., ‘v. 27, p. 155, 1963; Latner A. L. Isoenzymes, Advanc. clin. Chem., v. 9, p. 69, 1967.

Источник: xn--90aw5c.xn--c1avg

ИЗОФЕРМЕНТЫ
(изоэнзимы, изозимы), ферменты, катализирующие идентичные р-ции, но отличающиеся друг от друга строением и каталитич. св-вами. К И. относят только те формы ферментов, появление к-рых связано с генетически детерминир. различиями в первичной структуре пептидной цепи. Более широкое понятие — множественные формы ферментов — включает как И., так и те формы ферментов, к-рые обладают св-вами И., но образуются в результате посттрансляц. модификаций. Последние могут осуществляться, напр., в результате гликозилирования, фосфорилирования, аденилирования, амидирования и деамидирования остатков глутаминовой и аспарагиновой к-т пептидной цепи, а также путем частичного протеолиза последней с образованием более низкомол. продуктов. В модификации пептидных цепей участвуют специфич. ферменты — аденилилтрансфераза, гликозилтрансферазы, протеазы, фосфокиназы и др. И. свойственны большинству ферментов, в т. ч. их мембраносвязанным формам, участвующим в метаболич. процессах, обеспечивающих выделение энергии при физ. нагрузках и покое (напр., для изоцитратдегидрогеназы, пируваткиназы, фруктозодифосфатальдолазы). Состав и соотношение форм И. (спектр И.) изменяется в зависимости от их локализации в органах и тканях организмов одного вида и даже в разных субклеточных органеллах одной и той же клетки. На спектр И. оказывает влияние разное физиол. состояние организма и патологич. процессы, происходящие в нем. Поскольку И. различаются по своим св-вам (оптимуму рН, активации ионами, по сродству к субстратам, ингибиторам, активаторам, кофакторам), то характер их распределения отражает регуляторные механизмы, контролирующие метаболизм. Так, напр., лактатдегидрогеназа представлена в организме человека и животных пятью формами, каждая из к-рых представляет собой тетрамер, состоящий из субъединиц двух типов (a и b) в разных соотношениях. В сердце и печени представлена в осн. форма a4, а в мышцах — b4. Первая ингибируется избытком пировиноградной к-ты и поэтому преобладает в органах с аэробным типом метаболизма, вторая не ингибируется избытком этой к-ты и преобладает в мышцах с высоким уровнем гликолиза. О важной роли И. в тонкой регуляции метаболич. процессов свидетельствует также изменение их спектра под влиянием разл. воздействий и физиол. состояний (охлаждение, гипоксия, денервация и др.). Для исследования спектра И. используют ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, электрофорез и изоэлектрофокусирование, а также иммунохим. методы с использованием антител. Наиб. широко используется дискэлектрофорез в полиакриламидном геле. Однако применение только этого метода для поиска И. недостаточно, т. к. он не позволяет выявить генетически разл. формы ферментов, не различающиеся по заряду. В связи с этим для более полной характеристики спектра И. необходимо применять иммунохим. анализ и сравнивать спектры И. мутантов. При выявлении И. необходимо избегать условий выделения, при к-рых возможно возникновение артефактных форм. Так, для предотвращения частичного протеолиза в процессе выделения и хранения работу часто проводят в присут. ингибиторов протеаз. При разделении мембранных ферментов необходимо максимально снижать концентрацию детергента, что позволяет избежать появления новых форм в результате образования мицелл с разным содержанием искомого мембранного фермента. Процедура выделения И. должна быть максимально сокращена по времени. Анализ спектра И. в количественном и качественном отношениях в разл. тканях и органах человека имеет большое значение для диагностики нек-рых заболеваний, в т. ч. и связанных с генетич. аномалиями. Напр., инфаркт миокарда сопровождается резким увеличением активности двух форм лактатдегидрогеназ — a4 и b4, причем эта аномалия сохраняется длит. время и может служить показателем течения болезни. Разл. формы гепатита сопровождаются изменениями спектров аспартатаминотрансферазы, малатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы и нек-рых др. ферментов. При диагностике ряда онкологич. заболеваний данные по анализу спектра И. являются важным подтверждением диагноза и используются для прогноза метастазирования. Существование И. установлено в 40-50-х гг. 20 в., когда были существенно усовершенствованы методы разделения белков. Лит.: Уилкинсон Дж., Изоферменты, пер. с англ., М., 1968; Редькин П. С., «Успехи современной биологии». 1974, т. 78. № 4. с. 42-56; Денисова Г. Ф., там же, 1977. т. 84. № 1, с. 22-37; Мецлер Д., Биохимия, пер. с англ., т. 2. М., 1980. с. 66-68. Н. Д. Габриэлян.

Химическая энциклопедия. — М.: Советская энциклопедия. Под ред. И. Л. Кнунянца. 1988.

Источник: dic.academic.ru

Определение общей активности лактатдегидрогеназы
в сыворотке крови методом Севела‑Товарека

Принцип

Пировиноградная кислота, образованная в результате ферментативной реакции, в щелочной среде взаимодействует с 2,4‑динитрофенил­гидразином и образует окрашенный комплекс.

Нормальные величины

Сыворотка (указанный метод) 220‑1100 нмоль/с×л или
 13‑67 МЕ
(оптический тест) 140‑320 МЕ

Определение активности фракций ЛДГ
с помощью термоингибирования

Принцип

Ферменты, с преимущественным содержанием М‑субъединиц (ЛДГ‑4 и ЛДГ‑5) более термолабильны по сравнению с изоферментами, содержащими H‑субъединицы (ЛДГ‑1 и ЛДГ‑2).

Нормальные величины

Сыворотка при 56°С инактивация на 30%
при 65°С инактивация на 80%

Определение активности фракций ЛДГ
по инактивации мочевиной

Принцип

Заключается в ингибировании мочевиной активности изофермента ЛДГ‑5 почти на 100%.

Нормальные величины

Сыворотка (ингибирование мочевиной)   25‑36% общей активности
(электрофорез на ацетате целлюлозы) ЛДГ‑1 19‑29% общей активности
ЛДГ‑2 23‑37% общей активности
ЛДГ‑3 17‑25% общей активности
ЛДГ‑4  8‑17% общей активности
ЛДГ‑5  8‑18% общей активности

Влияющие факторы

Наркотические анальгетики и другие обезболивающие препараты, этанол, дикумарин завышают результаты исследования. Необходимо избегать гемолиза, так как в эритроцитах активность фермента выше, чем в сыворотке. Оксалаты и мочевина ингибируют фермент.

Клинико‑диагностическое значение

Все заболевания, протекающие с разрушением клеток, сопровождаются резким повышением активности ЛДГ в сыворотке крови. Нарастание общей активности фермента обнаруживается при таких заболеваниях как инфаркт миокарда, некротическое поражение почек, гепатит, панкреатит, воспаление и инфаркт легкого, опухоли различной локализации, повреждения, дистрофия и атрофия мышц, гемолитические анемии и физиологическая желтуха новорожденных, лимфогранулематоз, лейкозы. При инфаркте миокарда начало роста активности фермента в сыворотке крови отмечается на 8‑10 час от момента приступа, максимальное увеличение наступает к 24‑48 часу, нередко в 15‑20 раз превышая норму. Повышенная активность ЛДГ сохраняется до 10‑12 суток от начала заболевания. Степень нарастания активности фермента не всегда коррелирует с размерами поражения сердечной мышцы и для прогноза исхода заболевания может являться лишь ориентировочным фактором. У больных стенокардией активность фермента не изменяется, что позволяет применять тест для дифференциальной диагностики в пределах 2‑3 суток после сердечного приступа.

Наличие органной специфичности ферментов позволяет применять исследование их активности с целью топической диагностики .

Общая активность и изоферментный спектр лактатдегидрогеназы в сыворотке крови при некоторых заболеваниях
Заболевание Общая
активность
ЛДГ
Изоферменты
ЛДГ‑1 ЛДГ‑2 ЛДГ‑3 ЛДГ‑4 ЛДГ‑5
Инфаркт миокарда ++ + +      
Заболевания легких +     + +  
Вирусный гепатит +       + +
Токсический гепатит +       + +
Цирроз печени +       + +
Миелолейкоз ++   + +    
Гранулоцитоз ++   + +    
Разрушение тромбоцитов
(эмболии, гемотрансфузии)
+   + + +  
Панкреатит +   + +    
Мегалобластическая анемия +++ + +      
Гемолитическая анемия +++ + +      
Почечные заболевания ++ + +      
Миопатия ++ + +      

При заболеваниях печени сыворотка после инкубации при 56°С теряет около 50% своей активности, при 65°С — до 90%. При сердечных поражениях инактивация при 56°С достигает 10%, при 65°С — около 60%. Активность мочевиностабильной фракции при заболеваниях печени снижается до 20% от общей, инфаркт миокарда сопровождается возрастанием свыше 40% активности данной фракции. 

Источник: biokhimija.ru


Leave a Comment

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте, как обрабатываются ваши данные комментариев.