Сущность серологических методов исследования состоит в определении титра антител в сыворотке крови больного в динамике болезни по отношению к известному антигену, вводимому в серологическую реакцию.
В клинической практике чаще всего используется реакция агглютинации (РА) Видаля , ее разновидности, РНГА, РСК и более информативные современные методы (ИФА, РИА, ЛИФА и др.).
РА — определение неизвестных антител с помощью известных антигенов и установление вида возбудителя с помощью известных антител. РИГА и РНГА — более специфичны, используются меченные эритроциты. РТГА — основан на способности некоторых вирусов агглютинировать эритроциты. РИ — реакция иммунодиффузии, различная способность антигенов и антител диффундировать в геле. РСК титрование антигенов или антител по степени фиксации комплемента с комплексом антиген-антитело. PH — способность антител нейтрализовать токсины и антигены вирусов. ИФА — используются антитела, конъюгированные с ферментом. РИА — используется радиоактивная метка антигенов или антител. ЛИФА — лантанидный иммунофлюоресцентный анализ — используются в качестве метки элементы редкоземельных металлов.
Забор крови для серологического исследования выполняется так же, как и при посеве, но в отличие от последнего, его лучше осуществлять самотеком, а не шприцом. Для этого берут иглу с более широким просветом и вводят в локтевую вену без шприца. В пробирку собирают 3-5 мл крови. При таком сборе эритроциты меньше травмируются и сыворотка крови реже бывает с явлениями гемолиза. После отстаивания и центрифугирования крови сыворотку с помощью пипетки переносят в другую пробирку или эпиндорф и хранят в холодильнике при температуре +4 °С до постановки реакции. Поскольку иммунный ответ при большинстве инфекционных болезней развивается с 5-7-го дня, а максимальное нарастание титра антител происходит лишь в периоде реконвалесценции, серологические методы менее пригодны для ранней диагностики и используются главным образом в целях ретроспективной расшифровки этиологии уже перенесенного инфекционного заболевания.
Однако кровь для серологических исследований берется и в первые дни болезни , что в дальнейшем дает возможность наблюдать за нарастанием титра антител в динамике заболевания. Повторные серологические исследования при бактериальных инфекциях производятся не раньше, чем через 5-7 дней. При вирусных заболеваниях берутся «парные сыворотки» с интервалом 10-12 дней и при нарастании титра антител в 4 раза и более подтверждается диагноз предполагаемого заболевания.
Структура ответа. Методы серологической диагностики, суть. Правила забора крови. Трактовка результатов. Парные сыворотки.
Более новые статьи:
- Патогенетическая терапия инфекционных больных — Виды патогенетической терапии, группы препаратов, примеры заболеваний — 17/08/2012 07:55
Серологическое исследование, или, другими словами — серологический анализ, это исследование биологических материалов в лаборатории. Этот анализ позволяет установить наличие болезнетворных бактерий в исследуемом организме, либо — в продуктах, которые проходят контрольную проверку.
Серологические методы диагностики
Исследование сывороток или других биологических объектов (молока, желчи, слюны, смывов слизистой кишечника, а также — копроматериалов) дает достаточно достоверное представление об ответе организма на внедрение инфекционного агента. Следует отметить, что применение серологических методов исследования имеет не только диагностическое значение, но дает достоверные сведения об уровне защиты организма, состоянии популяционного иммунитета, циркуляции различных типов в обследуемом регионе. Результаты серологических обследований могут также дать информацию для оптимизации антигенного состава профилактических препаратов и использоваться с целью оценки иммунологической эффективности вакцин.
Однако нужно отметить, что необходимость исследования парных сывороток крови, забираемых с интервалами 1,5-2 недели, и наличие экспрессных методов диагностики снижают диагностическую ценность серологических реакций.
Поэтому традиционные серологические тесты — реакции связывания комплемента (РСК) и реакция торможения гемагглютинации (РТГА), находят в настоящее время лишь ограниченное применение. Тем не менее простота этих методов, доступность и дешевизна реагентов делают их еще применимыми в лабораторной практике. Постановка РСК и РТГА осуществляется по общепринятым методикам.
Примером использования РСК для изучения поствакцинального иммунитета является работа К. Мидхана (1989 г.). При обследовании сывороток от 116 детей в возрасте 5 месяцев достоверные сероконверсии, по данным РСК, были отмечены в 44% случаев, а по результатам реакции нейтрализации (PH) и имму-ноферментного анализа (ИФА) — в 83 и 96% соответственно.
Исследование иммунитета
С целью изучения популяционного иммунитета с помощью РСК нами было обследовано 1246 сывороток больных ОКЗ в возрасте от нескольких месяцев до 80 лет и старше. Показано, что среднегеометрические титры комплементсвязывающих антител были наиболее высокими в возрастных группах 2 — 4 и старше 60 лет, что подтверждает полученные нами ранее данные о наибольшем распространении ротавирусной инфекции среди лиц указанных возрастных групп.
Анализ на ротавирус
РТГА используется в изучении ротавирусной инфекции чаще, чем РСК, и, как правило, в сочетании с другими лабораторными тестами. Так, Andrade J. Р. et al. применили РТГА, иммуно-блот, блок ИФА для изучения антител к структурным белкам ротавируса VP2, VP4, VP6 й VP7. По данным авторов, у детей от 2 до 4 лет обнаружили антигемагглютинирующие антитела к ротавирусам в 70-80%.
В зависимости от уровня антител к определенным белкам, по данным РТГА, авторы выделили 4 группы лиц. В I и II группы (60%) вошли дети с высоким уровнем антител к VP4 и VP7 и были классифицированы как «иммунные». В III группу (4%) отнесены лица с низким уровнем антител к VP7 и VP6, так называемые «частично иммунные». Дети IV группы (36%), у которых, по данным РТГА, антитела не были обнаружены, обозначены как «неиммунные» и составили группу риска, т. к. среди них возможно развитие выраженной ротавирусной инфекции. Следует отметить, что в данном наблюдении показатели чувствительности РТГА и блок ИФА были вполне сопоставимы.
РТГА неоднократно использовали для изучения структурного белка VP4. Исследования показали, что его гемагглютинирующая активность специфически ингибируется антисывороткой, тем самым подтверждая, что VP4 является гемагглютинином ротавирусов. Аналогичные данные были опубликованы ранее М. Езекиелем (1995 г.).
Таким образом, представленные работы показывают, что РСК и РТГА все еще применяют при изучении ротавирусной инфекции, однако эти методы носят вспомогательный характер и должны дублироваться другими тестами.
Нейтрализационные тесты
Реакция нейтрализации основана на способности иммунных сывороток человека или животных нейтрализовать репродукцию вируса и тем самым предотвратить связанные с этим феноменом проявления. В зависимости от биологической модели этими проявлениями могут быть: развитие заболевания со специфической клиникой, репродукция и выделение вируса, выработка специфических антител, а также появление цитопатического эффекта или образование пляк при использовании культуры клеток.
Макробиологические модели в настоящее время применяются преимущественно в ветеринарии, обнаружение вирусов у людей в большинстве случаев проводится на культуре клеток, как первичных, так и переливаемых. Методы PH подразделяются на две группы по принципиальной схеме постановки. В одной группе методов неразведенная сыворотка соединяется с серийными разведениями вируса, в другой — разведения сыворотки испытываются с постоянной дозой вируса. Для постановки реакции нейтрализации предпочтителен возбудитель, вызывающий выраженный цитопатический эффект или интенсивно репродуцирующийся в биологической модели.
Однако ротавирусы, к сожалению, обладают слабо выраженным цитопатическим эффектом, что убедительно продемонстрировали исследователи под руководством Б. Вебера (1992 г.). Исследование 121 пробы кала больных ОКЗ детей с использованием классического метода выделения вируса на клетках МА-104 под контролем ЦПД выявило только 4 положительных случая (3,3%), тогда как применение современных методов обнаружения ротавирусов (ИФА, ПЦР, ЭФ в ПААГ) позволило повысить этот показатель до 54,4%.
едовательно, для повышения чувствительности PH требуются дополнительные методические приемы, способствующие визуализации редукции вируса, в качестве которых используются: радиоактивная или иммунофлюоресцентная метка, плякобразо-вание, иммунопероксидазная окраска и т. д. При этом следует отметить, что сам принцип определения уровня вируснейтрализующих антител идентичен классическому методу PH, отличаясь от него только способом разрешения, то есть, визуализацией вируснейтрализующей активности сыворотки. В этом случае активность сыворотки определяют по ее способности подавлять проявления инфекционных свойств вируса.
В настоящее время в большинстве исследований используются два метода измерения количества вируснейтрализующих антител к ротавирусу. Один из них основан на подсчете числа индивидуальных вирусинфицированных клеток (метод пляк), специфически связывающихся с антителами, конъюгированными флюоресцентом. В другом тесте об уровне нейтрализации вируса судят по снижению продукции вирусного антигена им-муноферментным методом. Сравнительное изучение обоих методов показало линейную зависимость между показателями ИФА и числом пляк-формирующих единиц для каждого прото-типного штамма серотипа ротавируса: Wa, DS-1, Р, VA-70.
лученные данные позволяют легко определить разведение сыворотки, обеспечивающее нейтрализацию 60% инфекционного вируса (нейтрализующий титр антител). Оказалось, что титры антител при тестировании материалов обоими методами одинаковы и оба теста не различаются по воспроизводимости результатов. Некоторое преимущество метода с использованием антител, меченных флюоресцеином, по мнению авторов, заключается в большей объективности учета результатов (автоматизированная регистрация) и в меньшей трудоемкости.
Для измерения титров вируснейтрализующих антител используют и модифицированную PH посредством блокирования ИФА с помощью моноклональных антител.
- изучению интенсивности выработки вируснейтрализующих антител (ВНА) при естественной инфекции и вакцинации;
- образованию ВНА к различным структурным белкам ротавирусов;
- оценке роли ВНА сывороток крови и секреторных антител слюны и слизистой кишечника в защите от естественной инфекции (Ward R. et al., 1990, 1992, 1993, 1995, 1997).
В заключение необходимо подчеркнуть, что реакция нейтрализации в различных ее модификациях до настоящего времени широко используется как в экспериментальных, так и клинических исследованиях и, обладая высокой чувствительностью и специфичностью, служит эталоном для всех других серологических методов.
Преципитационный анализ
Преципитационные тесты основаны на взаимодействии сыворотки с вирусными антигенами при помощи осмотических процессов или под влиянием электрического поля в гелевой среде или другого вида носителя. Одним из таких методов является реакция встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ). Авторы исследовали сыворотки крови здоровых и больных ротавирусной диареей взрослых и детей, а также препараты специфического иммуноглобулина на наличие антител к человеческому ротавирусу методом ВИЭФ в 7% агарозе с добавлением 4% полиэтиленгликоля. Оказалось, что антитела к RV циркулировали достаточно широко и обнаружены у больных взрослых и детей в 90,2-87,7% соответственно, а также у 78,4% здоровых детей в возрасте до 1 года. Все 32 серии иммуноглобулина содержали антитела к РВ в титрах 1:4- 1:128. По мнению авторов, метод пригоден для изучения популяционного иммунитета.
Радиоиммунопреципитация
Другой преципитационной методикой является радиоиммунопреципитация. Авторы использовали этот метод для изучения иммунного ответа к структурным и неструктурным белкам при первичной ротавирусной инфекции и показали, что иммунный ответ был более выражен к VP4, чем к VP7.
При изучении сывороточного и секреторного иммунологического ответа на применение тетравалентной реассортантной вакцины у новорожденных Для этого была использована радиоиммунологическая техника исследования наряду с ИФА и PH. При этом было показано, что иммунный ответ в сыворотке зависит от дозы вводимого антигена; что же касается выявления антител в слюне, то авторы объясняют их появление с потреблением грудного молока.
Реакция радиоиммунопреципитации используется и в тонких научно-исследовательских работах. Так, Дж. Тоссер использовал этот метод для изучения топологии белка VP6 в структуре генома и высказали предположение, что VP 6 участвует в образовании каналов внутреннего капсида.
Другие исследователи в 1994 году также использовали метод радиоиммунопреципитации для изучения иммунологических сдвигов при ротавирусной инфекции. Авторы показали, что в остром периоде регистрируются, главным образом, IgA к VP2 и VP6, в то время как в период реконвалесценции снижалась интенсивность выработки секреторных антител (IgA) не только к VP2, но и к остальным структурным и неструктурным белкам. Позднее аналогичные данные были получены с применением радиоиммунопреципитационного метода. Авторы показали, что в иммунологическом процессе, помимо VP4 и VP7, участвуют также VP2, VP6 и NSP2.
Таким образом, иммунопреципитация использовалась в диагностических целях для изучения иммунного ответа при естественной ротавирусной инфекции.
В последние годы иммунопреципитацию заменил метод радиоиммунопреципитации, который применяется для оценки поствакцинального и постинфекционного иммунитета при RV инфекции и для тонких научно-исследовательских разработок.
Гибридизационные методы
Для определения антител к ротавирусам широко применяют метод иммуноблота. Примером использования Western-blot в диагностике ротавирусной инфекции служит работа Х.
ижимы (1989 г.), который, с помощью иммуноблотинга, охарактеризовал специфичность антител к структурным белкам RV у 21 ребенка с ОКЗ, а также уровень копроантител классов IgA и IgG к этим белкам у неинфициро-ванных детей. Авторы высказали предположение, что иммуно-блотинг может позволить установить диагноз заболевания по одной пробе копроантител без исследования парных сывороток крови. Возможность применения Western-blot для определения уровня антител к VP1, VP2, VP4, VP6 и VP7 была продемонстрирована Павловым И. и др. (1991 г.). Авторы исследовали сыворотки крови людей и животных на наличие антител к штаммам ротавирусов SA-11, DS-1, Wan Ito и пришли к выводу, что Western-blot может быть с успехом использован для оценки иммунитета в клинической практике.
Полагают, что иммуноблот может быть использован для подтверждения диагноза ротавирусной инфекции без использования парных сывороток по одной пробе копроантител.
Наряду с РТГА и ИФА, иммуноблот использовали для изучения популяционного иммунитета. Обнаружена группа лиц, неиммунных по отношению к VP2, VP4, VP6 и VP7, которые представляют группу риска, в первую очередь требующую защиты средствами активной и пассивной иммунизации (Andrade J. Р. et al., 1996).
Применение иммуноблота в изучении серологических сдвигов в процессе естественной RV инфекции отмечают и Begue R. et al. (1998). Авторы подтвердили, что в иммунном ответе на инфицирование участвуют наиболее часто антитела к VP2 и VP6, менее часто — к VP7 и VP4.
Иммунофлюоресцентный анализ
Иммунофлюоресцентный метод в непрямом варианте с использованием антивидовых сывороток, меченных флюорохромом, применяется для титрования испытуемых сывороток на клетках, зараженных ротавирусами. В основе реакции лежит специфическое взаимодействие меченых антител и гомологичного антигена, при этом комплекс антиген-антитело легко обнаруживают с помощью люминесцентного микроскопа.
Используя этот метод, авторы провели серологическое обследование двух групп южно-американских индейцев и выявили высокий процент серопозитивных лиц в обеих группах: 67,8 и 77,4% по данным ИФА и 45,5 и 56,7% по результатам ИФМ соответственно.
В другом исследовании, посвященном определению уровня антител к RV группы С в пуповинной крови с помощью ИФМ, было показано, что у 30% женщин детородного возраста выявлялись эти антитела, свидетельствующие о перенесенной инфекции.
Иммуноферментный анализ используется в настоящее время наряду с PH в серологической диагностике ротавирусной инфекции чрезвычайно широко. Этот метод, основанный на использовании антител или антигена, меченных ферментом, благодаря простоте выполнения и экономичности наиболее приемлем и перспективен для серологической диагностики ротавирусной инфекции. Метод позволяет проводить массовые сероэпидемические обследования населения, оценивать иммунологическую и эпидемиологическую эффективность вакцин, изучать защитную роль антител различных классов в различных биологических жидкостях человеческого организма, а также осуществлять серологическую диагностику ротавирусной инфекции.
Многочисленные исследования с помощью ИФА были проведены Р. Азередо (1989 г.), которые показали, что число больных ОКЗ установленной ротавирусной этиологии было значительно ниже уровня их инфицированности по результатам серологического обследования. Эти данные обнаружили, что многие клинические случаи ротавирусной инфекции не диагностируются методом обнаружения RV в фекалиях. Дальнейшие исследования по изучению распространенности ротавирусной инфекции подтвердили это предположение. При проведении сероэпидемиологических обследований было обнаружено, что 50- 70% населения обладали высоким уровнем антител, что свидетельствует о широкой циркуляции RV в человеческой популяции.
Еще большие возможности открывает ИФА при определении динамики уровня антител, принадлежащих к различным классам иммуноглобулинов. Так, по данным авторы методики в 1989 году утверждают, что в процессе вакцинации достоверный прирост антител к RV в крови отмечался в 83-96%. Антиротавирусные антитела классов IgA и IgG одинаково хорошо выявляли ИФА и PH по редукции пляк — 67,6 и 70,0% соответственно. Сероконверсия антител класса IgM была обнаружена у 53 и 44% детей методами ИФА и РСК соответственно. По результатам анализа интенсивности выработки антител разных классов авторы сделали вывод, что наиболее эффективным, простым и быстрым методом выявления сероконверсий после вакцинации является способ обнаружения IgA антител с помощью ИФА.
Этот вывод нашел свое подтверждение и в работе Р. Бишопа (1996 г.), в которой указано, что по результатам обследования 68 пар мать-дитя с диагностированной RV инфекцией показано, что обнаружение антител класса IgA с помощью ИФА в копроматериалах служит наиболее чувствительным маркером как клинически выраженной, так и бессимптомной инфекции. Аналогичные результаты при обследовании детей с выраженной RV диареей были получены Дж. Коломиной в 1998 году.
Однако для изучения интенсивности сероконверсий необходимо исследование парных сывороток, что значительно удлиняет процесс диагностики. В то же время общеизвестно, что появление антител класса IgM является свидетельством начала инфекционного процесса. По нашим данным, полученным при обследовании больных ротавирусной инфекцией методами ИФА и РСК, оказалось, что, по результатам ИФА, все обследованные лица содержали в крови IgM антитела к RV, в то время как по данным РСК — только в 77% (Р
В последние годы с реализацией возможности определения гено- и серотипоспецифических антител ИФА стал поистине универсальным методом изучения ротавирусной инфекции, который используется:
- при изучении выработки антител классов IgA, М, G к отдельным структурным и неструктурным белкам RV;
- в оценке иммунологической эффективности различных видов вакцин: аттенуированных, холодоадаптированных, ДНК-овых, реассортантных;
- при изучении выработки антител в различных биологических жидкостях организма в условиях естественной инфекции и при иммунизации.
Таким образом, как следует из представленных данных, и иммунологические аспекты ротавирусной инфекции изучают при помощи широкого спектра лабораторных методов. Вследствие этого выбор оптимального метода исследования с учетом его разрешающей возможности, экономических и временных затрат достаточно сложен и зависит от задач, стоящих перед исследователями, а также оснащенности лаборатории. И все же из многообразия методов, на наш взгляд, следует выделить два — реакцию нейтрализации на культуре клеток и иммуноферментный анализ, — обеспечивающих изучение антител к различным классам иммуноглобулинов. Особую перспективность этих методов для использования в широкой практике определяет реализованная возможность экспресс-диагностики ротавирусной инфекции.
Источник: shashlika.ru
Исследование антител к Yersinia Enterocolitica серотип О:3 методом РПГА (реакция непрямой гемагглютинации). Кишечный иерсиниоз — острое инфекционное заболевание, характеризующееся преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта, с тенденцией к генерализованному поражению различных органов и систем. Возбудителем иерсиниоза чаще всего является мелкая грамотрицательная палочка Yersinia Enterocolitica серотипов О3, О8, О9. Y. enterocolitica распространены в природе широко. Они могут присутствовать в органах и фекалиях многих видов млекопитающих, птиц, земноводных, членистоногих, а также на овощах, корнеплодах, в почве, пыли, воде. Частый путь передачи инфекции – алиментарный (с заражённой пищей, молоком, водой). Человек, как правило, источником заражения не является. Частота выявление этого возбудителя в кале больных с поносом, по данным разных исследований, составляет 1-3%. Клинические формы иерсиниоза разнообразны и до некоторой степени обусловлены возрастом и физическим состоянием больного. У детей старшего возраста и подростков клиническая картина часто напоминает аппендицит, симптомы включают лихорадку и разлитую боль в животе. У взрослых иерсиниоз часто проявляется двумя синдромами – реактивным артритом и узловатой эритемой. Сначала наблюдается понос с лихорадкой и болью в животе, а через 1-2 недели развивается артрит, который обычно проходит через 1-4 месяца. Узловатая эритема как постинфекционный синдром отмечается преимущественно у женщин среднего возраста. Иерсиниоз в грудном возрасте опасен осложнением в виде сепсиса. Другие предрасполагающие факторы бактериемии включают заболевания печени, гемохроматоз, сахарный диабет, истощение, иммуносупрессивная терапия, передозировка препаратов железа. Более редкие формы иерсиниоза (атипичная клиника обычно обусловлена серотипами, отличными от Y. enterocolitica О3, О8, О9) – ангина на фоне кишечной симптоматики или без неё, пневмония, абсцесс лёгкого, инфекционный эндокардит, инфекции мочевых путей, абсцессы мягких тканей и конъюнктивит. Для лабораторного подтверждения иерсиниоза используют микробиологические тесты (см.тест №460 — Посев на иерсинии и определение чувствительности к антибиотикам), серологические исследования — в том числе, РПГА с Y.enterocolitica, выявление антител к факторам вирулентности Y.enterocolitica методом ИФА (см. тесты №№ 238, 239). Титр антител возрастает через 1 неделю заболевания и достигает пика на 2 неделе. Рекомендовано обследовать больного не менее 2 раз – в начале заболевания и с интервалом в 10-15 дней, диагностически достоверным считают 4-кратный и более прирост титров антител. При отсутствии возможности получения парных сывороток (обследование в боле поздние сроки) допускают использование условно-диагностических титров – при кишечном иерсиниозе для взрослых 1:200-1:400, для детей до 10 лет 1:100-1:200. В сомнительных случаях целесообразно проводить исследование параллельно с постановкой РПГА с Y.pseudotubercelosis, проявляющими иммунологическую общность с Y.enterocolitica. Ценность серодиагностики методом РПГА снижают потенциально возможные перекрёстные реакции (Brucella abortus, Rickettsia spp., Salmonella spp., Morganella morganii).
Источник: www.invitro.ru
При проведении анализа крови подсчитывается количество склеенных и выпавших в осадок эритроцитов. Результат исследования представляется как уровень титра антител и определяется как:
- положительный;
- ложноположительный;
- отрицательный.
При титре от 1:2 до 1:800 устанавливается подозрение на сифилис, что означает наличие в организме пациента антител к трепонеме. Однако это не указывает на присутствие болезни у человека. На первой стадии развития сифилиса показатели редко достигают уровня в 1:320. Вторая стадия заболевания определяется титрами, немного превышающими показатели в 1:320. При третьей, скрытой стадии болезни, показатели снова могут упасть ниже 1:320. Высокий уровень титра, превышающий показатели в 1:640, обычно выявляется при высокой активности инфекции.
Ложноположительными обычно являются показатели, превышающие значение 1:800. Также неспецифическими или ложноположительными могут быть значения менее 1:640. Подобные ситуации возможны при наличии таких факторов:
- поствакцинальный период;
- менструации;
- беременность;
- аутоиммунные заболевания;
- употребление жирной пищи накануне анализа;
- онкология;
- перенесенный за прошедшие 6–8 месяцев инфаркт миокарда;
- любые инфекционные заболевания;
- туберкулез;
- хронические патологии работы внутренних органов.
В том случае, когда пациент когда-либо ранее перенес сифилис, анализ РПГА у него будет положительным пожизненно, даже если человек здоров. Потому для уточнения ложноположительных и положительных результатов назначается дополнительное исследование в виде анализов крови РМП или РПР. Если РПР либо РМП отрицательный, то болезнь у пациента отсутствует.
При отрицательной реакции эритроциты не склеиваются в структуру. Такой результат проводимых исследований возможен в том случае, если болезнь у пациента отсутствует. Однако отрицательная реакция может проявиться и тогда, когда кровь для проведения исследования взята неправильно, либо с момента инфицирования прошло не более 4 недель и организм не успел начать выработку антител.
Довольно часто результаты теста записываются с условными обозначениями:
- 2+;
- 3+;
- 4+.
При этом 2+ означает, что наблюдается слабовыраженная реакция теста. Значение 3+ это положительная реакция, а показатель 4+ соответствует титрам с высокими результатами.
Источник: www.baby.ru
Принцип метода РНГА
При постановке реакции используются эритроциты (может использоваться латекс), которые имеют на своей стенке определенные антигены. К планшету с эритроцитами добавляется исследуемый материал. Если в нем имеются специфические антитела или белки определяемого возбудителя заболевания, то они вступают в связь с антигенами, слипаются и образуют видимый осадок.
Стандартный набор в основном содержит пустой планшет, эритроциты баранов, которые и имеют чувствительность к антигену выявляемого заболевания. Также в наборе присутствуют эритроциты, не имеющие антигенов. Контроли – положительный и отрицательный и стандартный реактив для разведения сывороток.
Самое главное в постановке реакции – это строгое соблюдение всех этапов. Для начала берут пустой планшет для РНГА, в лунки раскапываются последовательно заранее разведенные исследуемые образцы. В первую и последнюю лунки капают контроли. К сывороткам добавляют эритроциты со специфическими антигенами. Инкубируют планшет 2 часа.
Далее описывают визуальный результат. Он учитывается в крестах. Реакция считается верной только тогда, когда контроли прошли реакцию. Соответственно, в лунке с положительным контролем эритроциты располагаются по всему дну в виде хлопьев («зонтик»). В случае с отрицательным контролем на дне лунки выпадает маленькое четкое кольцо из эритроцитов («пуговка»).
Учет результатов
Результат учитывается по интенсивности осадка из эритроцитов в лунке.
- «-» отрицательный результат, как отрицательный контрольный образец, в виде плотного кольца на дне без какой-либо зернистости.
- «+» слабая интенсивность реакции, кольцо на дне в виде «пуговки», но при этом видны отдельные отложения эритроцитов. Результат описывается как «сомнительный». Обязательная пересдачи крови через 2 недели.
- «++» средняя интенсивность прошедшей реакции. Образовавшееся кольцо на дне лунки достаточно широкое с просветом в центре. Результат трактуется как слабо положительный.
- «+++» интенсивная реакция. В лунке эритроциты занимают всю поверхность, выпадают в виде «зонтиков». То есть с тонким кольцом по периферии. Результат оценивается как положительный.
- «++++» резкая интенсивность реакции. Вся лунка равномерно заполнена зернистыми выпадениями эритроцитов, иногда может быть в виде «зонтика». Также результат считается положительным или резко положительным.
Реакция может быть ложноположительной при протекании в организме человека тяжелых аутоиммунных заболеваний. Поэтому, если при пересдаче анализа реакция дает перекрест и результат отчитывается как ложноположительный, незамедлительно нужно обратиться к врачу для выяснения причины данной реакции.
Иногда этот метод принимают для подтверждения другого метода диагностики, основанного также на связывании антиген-антитело, называемого иммуноферментный анализ.
Подготовка к анализу
Чтобы не допустить ложноположительных результатов, к анализу нужно подготовиться заранее. Забор крови на данный анализ производится строго натощак и без употребления утром какой-либо жидкости. Нужно воздержаться от курения, хотя бы за час до сдачи анализа. Алкогольные напитки стоит исключить из рациона как минимум за сутки до анализа. Кровь на РНГА забирается из вены.
В настоящее время реакцию непрямой (пассивной) гемолитической агглютинации очень широко используют в медицинской лабораторной диагностике. Эта методика впервые была протестирована еще в 1965 году. И до сегодняшнего дня очень востребована. Она дает возможность не только определить, протекает ли в данный момент инфекционное заболевание у человека, но и на какой стадии оно находится.
Используют РНГА чаще всего для скрининга населения на наличие инфекционных заболеваний и для подтверждения положительных результатов, например, на сифилис. Основано это на том, что тест считается достаточно чувствительным и эффективным. Но при этом реакция проста в постановке и не требует много времени, результат можно получить уже в день сдачи крови.
Cергеева Екатерина Андреевна
Источник: comp-doctor.ru
Значение при самых ранних сроках и при выздоровлении
Поскольку антитела, принадлежащие к классу иммуноглобулинов G, сохраняются в сыворотке крови, как правило, пожизненно, то даже после активного и успешного лечения сифилиса с последующим выздоровлением эти антитела остаются положительными. Только в том случае, когда сифилис заподозрили и пролечили в «самом зародыше», через несколько дней после заражения, на стадии формирования твердого шанкра и регионарного лимфаденита, то тогда РПГА может быть отрицательной.
Тот факт, что и при вторичном сифилисе, и при третичном РПГА будет одинаково положительной, то это значит, что такое исследование нельзя использовать для дифференциальной диагностики стадий заболевания. С помощью РПГА также невозможно оценить эффективность лечения, поскольку при этом антитела всё равно будут циркулировать в крови. Эффективность терапии необходимо оценивать с помощью других лабораторных анализов. Особенно высокие показатели, то и значительное разведение сыворотки крови пациента при проведении РПГА возникают при вторичном сифилисе, а также при ранней и скрытой форме этой болезни.
РПГА
Найдено (1596 сообщений)
-
венеролог
13 февраля 2019 г. / Сергей -
Здравствуйте.
Доктор, 3 месяца сдавать на сифилис после момента полового акта или с момента возникновения язвы на члене? открыть (еще 2 сообщения)Последние 5:
-
15 февраля 2019 г. / Сергей
-
Сергей Куликов,
Сходил сегодня в квд.
Сдал названия РПР и РПГА, к обеду сделали, оба отрицательные.
А как вы написали содержимое язвы проверить так даже не предложили!
-
венеролог
27 декабря 2018 г. / Лана / Уфа -
… перед операцией в КВД и каждый раз одно и то же. Ифа суммарно 0,278/0,277, ифаLgm отрицательно,ИФАLgg отрицательно, РПГА отрицательно, МР отрицательно. Дают справку отрицательно. Я уже Незнаю что и думать почему у ифа суммарно показывает такую цифру.? Я … открыть
-
29 декабря 2018 г. / Лана
-
Доктор,
В том то и дело когда сдаю ифа суммарно она говорят положительно 0,277/0,278 , а развернутый имуноглобулины и рпга и мр все отрицательно. Это мне в КВД делают . Что может дать такую ифа суммарно? Это уже не первый раз года три так. Они говорят …
-
инфекционист
27 декабря 2018 г. / Лана -
… . Я уже запуталась сдаю в КВД скрнинг перед операцией ифа суммарно 0,278/0,277, ифа Lgm отрицательно, Lgg отрицательно, РПГА отрицательно, МР отрицательно. И это уже третий год такие результаты,. Говорят если имуноглобулины отрицательно ,то ифа суммарно … открыть (еще 1 сообщение)Последние 5:
-
венеролог
25 декабря 2018 г. / Эллина / Москва -
Здравствуйте! Подскажите, пожалуйста, может ли давать анализ IgM на сифилис давать ложноположительный результат из-за возможного заражения вич? То есть, если в данный… открыть (еще 4 сообщения)Последние 5:
-
26 декабря 2018 г. / Эллина
-
РПГА, IgG, RPR — отрицательно.
была в 3 клиниках и в КВД. везде говорят, что это ложноположительнвя реакция.
Возможно из-за хламидиоза или герпеса, если они в активной стадии.
скажите, пожалуйста, это действительно так?
просто я боюсь, что если это …
-
венеролог
13 декабря 2018 г. / Ирина / Москва -
Ифа суммарные отрицательно, ифа igg,igm отрицательно; Рмп отрицательно; рпга положительный. Это сифилис? Никогда не болела, не лечилась, проявлений не было. открыть
-
венеролог
4 декабря 2018 г. / Пух -
Здравствуйте, скажите пожалуйста ваше мнение,на сколько достоверны анонимные анализы в отличае от анализов по паспорту. Спасибо. открыть (еще 5 сообщений)Последние 5:
-
7 декабря 2018 г. / Аноним
-
Пух,
РМП, ИФА, РПР, РПГА
-
венеролог
22 ноября 2018 г. / Ирина / Москва -
Анализ на сифилис:
Ифа качественно и количественно не обнаружено
Рмп с кардиолипиновым антигеном отрицательно
Рпга обнаруженоУ меня сифилис? Я два года в протоколах ЭКО, сдаю этот анализ каждый месяц, всегда был отрицательный открыть
-
22 ноября 2018 г. / Сергей Куликов
-
Нжуно дойти до врача, пройти осмотр, повторить (перепроверить) исследования (РПГА, ИФА сумм., РИФабс.) и тогда уже решать.
-
венеролог
16 ноября 2018 г. / Аноним / Санкт-Петербург -
… !В 2010 г выявлен нейросифилис поздний(диагноз поставлен после проведения пункции).Проведено 2 курса лечения пенициллином внутривенно.М/р 4+1/4, РПГА 4+,РИФ 4+.Доп лечение в 2011г +пункция повторно-без изменений. Доп.лечение в 2013г-все анализы без … открыть
Показания к проведению
РПГА тест обычно назначают на профилактических осмотрах и перед госпитализацией. Также это один обязательных тестов для тех, кто хочет стать донором. В первую очередь, эта проверка необходима при планировании беременности, и в случае выявления клинических признаков сифилиса. К последним относятся:
- симметричные высыпания по всему телу;
- увеличение лимфоузлов;
- безболезненные язвочки в области половых органов;
- обильное выпадение волос.
Проверка крови методом РПГА показана людям, которые контактировали с инфицированными сифилисом и тем, кому требуется подтверждение результатов, полученных при другом исследовании.
Назначение на исследование может дать терапевт, дермато-венеролог или другой узкий специалист. Если у вас есть желание пройти это обследование, то вы можете обратиться в любую поликлинику.
Анализ крови методом РПГА, также могут назначить для поверки на:
- корь;
- дифтерию;
- столбняк;
- коклюш;
- сальмонеллёз.
Обязательно нужен при оформлении некоторых документов, например, санитарной книжки, и для подготовки к хирургическому вмешательству.
НЕТРЕПОНЕМНЫЕ ТЕСТЫ
Реакция Вассермана- РВ, RW, в среднем, становится положительной на 4-6 неделе заболевания. С увеличением поступления возбудителя сифилиса в кровь растет и титр RW. Своего максимума он достигает во вторичном рецидивном периоде сифилиса. При поздних формах заболевания реакция Вассермана нередко становится отрицательной.
Результат реакции Вассермана определяется наличием или отсутствием гемолиза. RW резко положительная — ++++, полная задержка гемолиза, RW положительная -+++, значительная задержка гемолиза, слабоположительная rw -++, +- сомнительная RW- частичная и соответственно незначительная задержка гемолиза. Отрицательная RW — полный гемолиз.
Недостатком RW является ее неспецифичность, т.е. реакция Вассермана становится положительной при отсутствиии сифилиса. Такой анализ называется ложноположительный.
Реакция Вассермана может быть ложноположительной при различных заболеваниях и состояниях — болезни соединительной ткани ( системная красная волчанка, системная склеродермия, дерматомиозит), ревматоидный артрит, туберкулез, онкология, болезни крови, заболевания сердечно-сосудистой системы — инфаркт миокарда, сахарный диабет, заболевания почек, беременность , употребление лекарственных препаратов и т.д.
Из-за неспецифичности реакции Вассермана, ее ложных результатов также используются другие реакции.
Реакция микропреципитации (РМП) и ее аналоги: RPR тест — Rapid Plasma Reagins и тест VDRL (Venereal Diseases Research Laboratory) — это нетрепонемные тесты, которые широко применяются в качестве отборочных реакций на сифилис.
Реакцию микропреципитации целесообразно сдавать через 20-30 дней после опасного контакта.
Суть реакции РМП — несколько капель сыворотки крови обследуемого смешивается с кардиолипиновым антигеном, в ходе реакции выпадает осадок — преципитат. Реакция оценивается качественно — по количеству +, от 4+(резко положительный) результат, до1+(сомнительный результат). В случае положительного результата проводят количественную оценку — титрование — максимальное разведение, при котором образуется осадок-преципитат. Результат является положительным начиная с титра 1:2-1:4. В подавляющем большинстве случаев положительный результат микрореакции означает заболевание сифилисом. Однако, микрореакция бывает ложноположительной при системных заболеваниях — системная красная волчанка, ревматоидный артрит, гломерулонефрит, сахарный диабет; при онкологических процессах, заболеваниях сердца — острый инфаркт миокарда, эндокардит, миокардит; при беременности и т.д.
Отрицательный результат микрореакции свидетельствует об отсутствии сифилиса, о раннем серонегативном периоде заболевания, до появления антител в крови. Также микрореакция становится отрицательной или сомнительной при поздних формах сифилиса.
Акция!!! Анализ крови на сифилис, ВИЧ, СПИД, гепатиты — 2500 руб.!
Телефон: 8 985 9230340
РМП является одним из критериев достоверности проведенного лечения сифилиса. В отличие от других серологических реакций — РИФ, РИБТ, ИФА, РПГА, после успешного лечения сифилиса РМП становится отрицательной более чем в 90% случаев.
Нетрепонемные тесты (реакция микропреципитации (РМП) и реакция Вассермана (RW)) относятся к неотъемлемым методам диагностики сифилиса. Отрицательный результат этих реакций в подавляющем большинстве случаев означает, что обследуемый здоров. В противном случае, при получении положительных результатов анализов назначаются трепонемные тесты.
Альтернативы
Так как мы уже выяснили, что ни одна методика, в том числе РПГА, не дает стопроцентной уверенности в результате, не вызывает удивления, что медики назначают обширные обследования. В таких комплексных исследованиях удачно комбинируются как специфические и так неспецифические методы тестирования, что позволяет, практически полностью, исключить вероятность ошибочной диагностики.
Итак, в комплексе с РПГА или вместо неё используют такие неспецифические тесты, как реакцию Вассермана и микрореакцию преципитации. И первый, и второй метод, требуют использования крови из пальца и не используется на начальных этапах течения болезни.
Из специфических тестов, которыми можно заменить РПГА, стоит отметить:
- ИФА или иммуноферментный анализ. Это один из наиболее точных методов диагностики, который обычно назначают, после прохождения неспецифических исследований.
- РИФ или МФА. Метод флуоресцирующих антител. Подходит для диагностики на ранних стадиях.
- TPI — Treponema pallidum immobilization test. Точный метод, но используется, только после четвертого месяца болезни.
- ИБ. Иммуноблоттинг или вестернблоттинг. Новый метод. Очень точный и очень дорогой.
- Лабораторный анализ. Быстрый и недорогой.
Суммируя все написанное, можно сделать вывод, что проверка крови на РПГА, это современный и достаточно точный метод для проверки здоровья. Благодаря тому, что РПГА относительно несложный и недорогой анализ, он используется повсеместно.
Что такое РПГА в анализе крови
Этот способ исследования (реакция пассивной гемагглютинации, РПГА) имеет и второе название: реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). И в практике может встретиться как аббревиатура РПГА, так и РНГА. Что это за анализ? Для него необходима центрифугированная сыворотка крови пациента, которую совмещают с особым диагностическим реагентом. Классически он называется «эритроцитарный антигенный диагностикум». Для его приготовления долгие годы использовались клетки красной крови, или эритроциты. Но так было сравнительно давно, а в настоящее время биологический материал уже не используют, и вместо этого применяют микроскопические частицы латекса.
На эти частицы с помощью особой технологии наносят характерные для данного инфекционного возбудителя антигены, которые являются его «визитной карточкой». В результате получается множество частиц, на поверхности которых находятся адсорбированные, и крепко связанные с носителем активные молекулы антигена.
В том случае, если в сыворотке крови пациента находятся выработанные к данному возбудителю антитела, то эти частицы латекса или эритроциты, склеиваются антителами между собой, и выпадают в осадок, который называется агглютинацией (переводе означает «склеивание»). Эту реакцию ставят в специальных планшетах, которые выполнены из пластика и рассчитаны на небольшие объемы. А раньше анализ крови на РПГА проводилась с набором обычных пробирок. В них в разных разведениях находилась кровь пациента, к которой и добавляли диагностикум.
В некоторых случаях применяется зеркальный метод, когда диагностикум содержит не антигены, а антитела. Этот метод (РОНГА, или обратная гемагглютинация) применяется при поиске инфекции, при которых в крови циркулируют токсины, например при ботулизме. В таком случае, если у пациента в крови есть ботулотоксин, то он связывается со специфическими антитоксическими антителами диагностикумов, и также наблюдается реакция агглютинации, которую можно определить в зависимости от разведения сыворотки крови.
Расшифровка складывается из самого факта агглютинации, и того максимального разведения сыворотки крови, при которой она еще уверенно определяется. Чем больше разведена кровь, при которой еще есть агглютинация, тем больше в организме пациента находится антител, и тем выше специфическая напряженность иммунитета при классическом проведении этой реакции. Наиболее часто используется разведения от 1:20 до 1:160 и выше. В настоящее время непрямую РНГА чаще всего используют для первичной диагностики сифилиса.
Справка о сифилисе
Сифилис – хроническое инфекционное ЗППП, вызываемое бледной трепонемой. Бледная трепонема – микроорганизм из порядка спирохет, которые представляют собой бактерии в виде спиралей.
Бледная трепонема в отличие от других спирохет имеет от 8 до 15 завитков, двигается плавно и медленно
Есть несколько путей заражения сифилисом:
- Прямой (половой), преобладающий.
- Косвенный (бытовой).
- Трансплацентарный (от женщины к плоду).
Бледная трепонема способна поражать практически все ткани организма
Сифилис принято разделять на несколько этапов:
- Инкубационный период.
- Первичный сифилис.
- Вторичный сифилис.
- Третичный сифилис.
Инкубационный период длится около двух недель, при этом нет никаких видимых признаков заражения. Бледная трепонема в этот момент активно осваивается в организме, размножается. Вследствие этого на коже/слизистой, в том месте, через которое попали микроорганизмы, формируется первичный очаг.
Первичный очаг представляет собой узелок, твердый и безболезненный, характерно его покраснение. Такое образование, иначе именуемое твердым шанкром, указывает на начало первичного сифилиса. По прошествии некоторого времени (до 2-3 недель) поражаются ближайшие лимфоузлы.
На фото в центре изъязвленного твердого шанкра красное дно: под ним множество мелких сосудов
Во время вторичного сифилиса на коже больного обнаруживаются множественные высыпания. Они могут быть разных форма и размеров, называются сифилидами. В каждом таком сифилиде содержится огромное количество трепонем, потому период считается самым заразным.
В настоящее время редко встречается последняя стадия, так как она развивается лишь через годы от момента заражения. Кроме того, заболевание вполне успешно поддается лечению, если проходить терапию на первых этапах.
Во время третичного сифилиса поражаются внутренние органы и системы, это может приводить к летальному исходу. Для этого периода характерны гуммы – особые отграниченные зоны воспаления, которые имеют хронический характер. Эта стадия практически не несет опасности для окружающих.
В центре гуммы располагаются трепонемы и зона мертвых клеток (некроза), иммунная система не справляется с их уничтожением. Иммунные клетки вокруг центра видоизменяются, укрупняются
Проанализировав все вышесказанное, можно выделить несколько критериев, которые влияют на выраженность и локализацию поражения:
- путь проникновения трепонемы в организм;
- стадия заболевания;
- время начала лечения и сам подход к терапии.
Подготовка и показания к РПГА
Подготовки к анализу никакой не требуются, единственное исключение сделано для курящих. Последняя сигарета должна быть выкуренной не раньше, через 30 минут до сдачи крови, а лучше вообще отказаться от курения в этот день. Забирается венозная кровь из локтевой вены, и показано проведение этого исследования четырем группам пациентов:
- лицам, у которых есть симптомы и признаки сифилиса (к ним относятся вероятный шанкр, увеличение регионарных паховых лимфоузлов, непонятная кожная сыпь на фоне подозрительного анамнеза, вялотекущий менингит, диффузное облысение, симптомы сифилитической лейкодермы во втором периоде, либо подозрение на образование гумм, признаки спинной сухотки, звездчатые рубцы, говорящие о запущенном третичном сифилисе;
- лица, находящиеся в половом и бытовом контакте с больными;
- доноры;
- оформление санитарной книжки, профилактические медицинские осмотры, плановая госпитализация в лечебное учреждение.
Пятой категорией лиц являются те пациенты, у которых была выявлена положительная реакция на сифилис, полученная другими методами диагностики, чаще всего реакцией Вассермана.
Кто в зоне риска
Для проведения РПГА требуется направление от врача. Направить пациента на анализ могут в нескольких случаях:
- Если имеются видимые признаки болезни. Сюда относятся язвы на коже, увеличенные лимфоузлы, частичное облысение волосяного покрова и пр.
- Если у пациента был прямой контакт с больными сифилисом, для профилактики ему также необходимо пройти обследование.
- Все доноры, сдающие кровь, обязаны проверяться на сифилис перед процедурой.
- Для оформления санитарной книжки или ежегодных профосмотров на предприятиях также потребуется пройти необходимые обследования.
- Если скрининг дал положительный результат.
- На сифилис проверяют каждого, кого готовят к госпитализации в стационар.
- Обследование пациента перед любой операцией также требует прохождения обследования.
Врач может назначить РПГА не только при подозрении на сифилис или для планового осмотра, но и для диагностики следующих заболеваний:
- дифтерии;
- дизентерии;
- сальмонеллеза.
С — 20. Серологические реакции РНГА или РПГА с одним диагностикумом
Особенности
- Стоимость: .
- Срок исполнения: 4 рабочих дней.
- Где можно сдать: В медицинском центре «ДИАМЕД» взятие биоматериала не производится. Необходимо по предварительному звонку заказать в центре «ДИАМЕД» стерильную пробирку и ознакомиться с правилами забора биоматериала в справочно-информационной службе по тел. (8342) 322-889
- Подготовка к анализу: Венозная кровь сдается утром натощак из вены.
Описание
Общая характеристика.
Реакция гемагглютинации. В основе реакции прямой гемагглютинации лежит способность эритроцитов склеиваться при адсорбции на них определенных антигенов. Поскольку это происходит без участия иммунной сыворотки, реакция не является серологической. В серологических исследованиях реакцию прямой гемагглютинации применяют для выбора рабочего разведения антигена, используемого в реакции торможения гемагглютинации. В основе последней лежит задержка гемагглютинирующего действия антигена специфической сывороткой.
Реакция непрямой гемагглютинации (пассивная гемагглютинация) наступает в том случае, когда к эритроцитам, сенсибилизированным антигеном, т.е. несущим на себе адсорбированный антиген, добавляют иммунную сыворотку, соответствующую антигену. Эта реакция часто превосходит по чувствительности и специфичности другие серологические методы, ее применяю при инфекциях, вызванных бактериями и риккетсиями. Реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА или РПГА) с танизированными эритроцитами проводят в двух вариантах: с известным антигеном для обнаружения антител (по Бойдену) и с известными антителами (сывороткой) для выявления антигена (по Рыцаю). Антигенами в реакции непрямой гемагглютинации могут служить очищенные антигены соответствующих микробов, экстракты бактериальных взвесей, надосадочные жидкости формалиновых, спиртовых, гретых бактериальных вакцин.
Показания к назначению анализа
Бактериальные инфекции, сальмонеллез, сыпной тиф, паратифы А и В, дифтерия, менингококковая инфекция и др.;
Идентификация выделенных микробов.
Материал для исследования: венозная кровь.
Метод: серологический.
Результат
Указывается наличие или отсутствие патогенных микроорганизмов и их видовая принадлежность. При получении их роста определяется чувствительность к антибиотикам.
Результат: в норме не обнаружено.
Интерпретация результата: В норме результат отрицательный.
Отсутствие роста в посеве может косвенно свидетельствовать в пользу кишечной инфекции, вызванной патогенными микробами (особенно на фоне начатого лечения). В острый период заболевания резко нарушается видовой состав микрофлоры кишечника, и нормальные представители вытесняются патогенными. При низком титре последних может наблюдаться отсутствие роста какой-либо флоры. В этом случае рекомендуется повторное исследование.
Источник: obsleduem.net